膨胀石墨电极中制备及用于色氨酸电化学的研究检测方案(电化学工作站)

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分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告Chinese Joumnal of Analytical Chem istry第1期62~66第37卷2009年1月 第1期赵炜等：膨胀石墨电极的制备及用于色氨酸电化学检测的研究63 膨胀石墨电极的制备及用于色氨酸电化学检测的研究 赵炜：1，2 孔泳1，2 i锦晴2，3 陈智栋*1，2 (江苏工业学院化学化工学院，常州213164) ‘(江苏省精细石油化工重点实验室，常州213164)(扬州大学化学化工学院，扬州225002) 摘 要 以化学氧化法制备了膨胀石墨，再以石蜡作为粘合剂制备了膨胀石墨电极，该电极兼备电化学传感器和富集待测物分子，缩短传质过程时间的特点。优化了测定条件，在此基础上建立了一种直接测定色氨酸的电分析方法。结果表明：在0.02~0.12 mmol/L范围内，电极响应与色氨酸浓度呈良好的线性关系，检出为20X10mol/L，RSD为24%。该电极具有良好的选择性，除酪氨酸外，浓度高达 5.0 mmol/L (色氨酸浓度的100倍)的其它8种氨基酸在电极上均没有可测的响应。用该电极测定了医用氨基酸注射液中色氨酸的含量，结果与标称值相符。对色氨酸在膨胀石墨电极表面的富集原因和反应机理进行了初步探讨。 关键词 膨胀石墨电极，色氨酸，差分脉冲伏安法，选择性 1 引 言 氨基酸的分析测试一直是人们研究较多的课题。检测氨基酸的传统方法主要有光谱法(包括紫外可见光谱、荧光、化学发光等)，然而大多数氨基酸在紫外可见光谱区的吸收极弱，自身又无荧光，不能直接进行检测，通常需要衍生化处理提高检测的灵敏度和选择性 1] 近年来，电化学法检测电活性氨基酸以其简单、灵敏、无污染等特点越来越受到人们的关注2~615]膨胀石墨既有优良导电性和吸附性，又有良好的化学稳定性，其用于电化学法检测电活性氨基酸却还未见报道。 本实验根据文献「8]制备了无硫膨胀石墨，以固体石蜡作为粘合剂制成膨胀石墨电极，该电极可用于色氨酸(Tm)的直接电化学检测。应用差分脉冲溶出伏安 (DPA)技术，成功地实现了 Tp的选择性检测，并具有较低的检出限和良好的重现性。用该电极测定氨基酸注射液中 Tmp含量，结果与标称值相符。 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 LK98BⅡ型微机电化学分析系统(天津兰立科化学电子高技术有限公司)，460型 Fourier变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)，D /max 2500型X射线粉末衍射仪(日本理学)，M ini 1240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，pHB-1型酸度计(上海世诺物理光学仪器有限公司)，ASAP2010C型吸附仪(美国Micrmeritics公司)，电化学检测系统采用三电极体系：工作电极为自制的膨胀石墨电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝。 色氨酸、苯丙氨酸赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙该酸、组氨酸(中国医药集团上海化学试剂公司)；酪氨酸、胱氨酸和半胱氨酸(上海润捷化学试剂有限公司)；复方氨基酸注射液(18AA)(批准文号：国药准字 H19993589，四川科伦药业股份有限公司)。其它化学试剂均为分析纯。所用水为18.3M2 cm超纯水。 2. 2 膨胀石墨电极的制备 根据文献[8]，以化学氧化法制备膨胀石墨。准确称取膨胀石墨与固体石蜡(质量比为23)于烧杯中，微热至石蜡全熔(熔点为56~62℃)，同时搅拌使两者混合均匀。冷却至室温后，将混合物填入长720 mm X5mm id的玻璃管一端，填充深度为0.5mm，插入中=2mm的铜丝实现电路连接。将电极 ( 2008-05-16收稿；2008-08-31接受 ) ( 本文系国家自然科学基金 (No. 20805021)、江苏省自然科学基金 (No BK2008542)、江苏省商校自然科学基金(No 08KJD150012)和江 苏省精细石油化工重点实验开放课题(No KF0703)资助项目 ) ( * E mail： c zd _ chen@yahoo. com. c n ) 截面抛光，用去离子水冲净后待用。重新抛光可使电极表面更新。 2.3 实验方法 将以膨胀石墨电极为工作电极的三电极体系置于含 50 umol/L Tm的KCl溶液中，用 HCl调其 pH值至2.0.用DPA法记录 i-E曲线，实验条件为：-0.1V电位下富集80 s，从0.4V扫描到1.3V。其它氨基酸的测定方法相同。测定前，所用溶液均通氮气除氧。 3 结果与讨论 3.1 膨胀石墨电极的电化学窗口 分别以膨胀石墨电极和碳糊电极为工作电极，在-1.2~1.6V(vsVSSCE)的电化学窗范围内，在支持电解质溶液(KCl，pH2.0)中进行 CV扫描。由图1可知，膨胀石墨为工作电极时，由支持电解质引起的背景电流与用碳糊为工作电极相比，几乎可以忽略不计，这说明膨胀石墨非常适合在实验所选用的条件下作工作电极。同时，这两种电极的电位窗上限(1.6V)都高于水的分解电位(1.2V)，这也说明用膨胀石墨电极进行电化学检测时，水不会发生分解而干扰氨基酸的检测。 3.2 色氨酸在膨胀石墨电极上的电化学响应 3.2.1 石蜡含量对峰电流的影响 考察 Tmp在不同含量石蜡的电极上的电化学响应，石蜡含量为40%时，基线噪音小、峰电流最大。所以，实验选用含40%石蜡的膨胀石墨电极为工作电极。 3.2.2 电解液的类型及 pH值对峰电流的影响 考察了 Tm在不同电解液(邻苯二甲酸酸钾、HClH， SOA、KC1KNO，)中的电化学响应，当用KC1作支持电解质时，得到的 Tmp氧化峰的峰形好，峰电流也较大。同时考察了不同浓度的KCl溶容液，其浓度对峰电流影响不大，因此，本实验选用0.1 mol/L KC1作为电解液。 考察了 Tr在 pH1.0~10.0范围内的KCl溶液中的电化学响应。当Tm浓度为5.0 X10 mol/L时，按上述的实验条件用 DPA法测定。pH值与其氧化峰电流的关系如图2所示，得到在pH2.0的溶 图1 膨胀石墨电极(a)和碳糊电极(b)的循环伏安图 图2 色氨酸氧化峰电流与pH的关系图 Fig 1 Cyclic voltammograms of expanded graphite (a)and carbon paste(b) Fig 2 Relationship beween oxidation peak current oftryptophan (Tp) and pH value 电解液(electrolyte)： 0. 1 mol/L KC1(pH=2.0)；扫描速度(scan rate)： 100 mV/s. 液中，峰形最好，且L'Tmp的氧化峰电流最大，故选pH 2.0的0.1mol/L KC1作为电解液。 电解液 (electrolyte)：0.1 mo1/L KCl； 色氨酸 (concentration ofTrp)： 5. 0 ×10mol/L；富集电位 (enrichment potential)：-0.1V；起止电位(initial and temm inal potential)：0.4~1.3V；富集时间(enrichment time)： 80 s. 3.2.3 色氨酸的氧化峰电流与富集电位和富集时间的关系 将膨胀石墨电极置于上述相同溶液中，分别在-0.4、-0.3、-0.2、-0.1、0.0、0.1和0.2V的电位下富集80s.当富集电位为-0.1V时，峰电流达到最大值，如图3所示。故实验选择富集电位为-0.1V。 将膨胀石墨电极置于含50 umol/L Tmp的 KC1(pH=2.0)溶液中，在-0.1V时分别富集20、40、60、80、100、120和200s。结果表明。当富集时间<80s时，Tm的氧化峰电流随着富集时间的增加而迅速增大，随后 Tm在电极表面的吸附趋于饱和，峰电流基本不变。所以本实验选择富集时间为80s. 3.3 膨胀石墨电极的分析性能 实验结果表明，当Tmp的浓度在 0.02~0.12 mmol/L时，其氧化峰电流与其浓度之间有良好的线性 关系，线性回归方程为y=2204 +168 66x，r为0.9928，检出鼠为2.0X10mol/L(S/N=3)。 电极立即检测与放置2个月后再进行检测的结果相比较，Tmp的氧化峰电位和峰电流均无明显变化，说明该电极的稳定性良好。平行测定 50 pmol/LTm溶液8次，RSD为2.4%，说明电极具有良好的重现性。 3.4 其它氨基酸对色氨酸测定的干扰 当 Tm浓度为 5 ×10mol/L时，按相同的实验方法，对100倍浓度的苯丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸进行测定，除酪氨酸(Tyr)有电化学响应外，其余氨基酸均无响应。但在实验条件下，两倍浓度的 Tyr不影响 Tmp的测定(图4)。可见该电极具有较好的选择性，对 于一般样品可直接测定其中 Tmp的含量。 3.5 实际样品的测定 膨胀石墨电极为工作电极，采用选定的实验方法对复方氨基酸注射液中的匀 Trp(稀释后 Tmp的含量为3.14mg/L)做加标回收实验，结果见表1。 表1 复方氨基酸注射液中色氨酸的加标回收实验结果 Table 1 Recovery of Trp in compound am ino acid injection samples 原始样品 Tp加入量 测得总量 回收率 Original Added Found Recovery (mg/L) (mg/L) (mg/L) (%) 3.14 4.08 7.19 99.0 3.14 8.17 11.43 101.4 3.14 12.25 15.48 100.7 3.14 16.34 19.14 97.9 3.14 20. 42 23.10 98.3 3.6 电极反应机理的探讨 实验所用电极是膨胀石墨和固体石蜡的混合物。文献[9]报道了液体石蜡对 Tmp和Tyr均有萃取富集作用，但未 图3 色氨酸氧化峰电流与富集电位的关系图 Fig3 Relationship between oxidation peak current ofTp and enrichment potential 电解液(electrolyte)： 0. 1 mol/L KC1 (pH=2.0)；色氨酸 (Tp)： 5.0 ×10mol/L；起止电位(initial and temm inal poten-tial)：0. 4~1.3V；富集时间 (enrichment time)：80 s. 图4 色氨酸(a)和酪氨酸(b)在膨长石墨电极上的DPA图 Fig 4 Differential pulse stripp ing voltammo-gram s of Tmp (a) and Tyr(b) Trp： 5.0 ×10-mol/L； Tyr： 1 x10mol/L；电位增量 (potential increment)：0. 01V；脉冲幅度(pulseamplitude)：0.1V；脉冲宽度 (pulse width)： 1. 0 s；冲间隔 (pulse interval) ： 0. 2 s；平衡时间 (equilibriumtime)：10 s；其它条件同图 3(other conditions are thesame as in Fig 3)。 见有关用固体石蜡对氨基酸选择性富集的报道。图5a是仅用膨胀石墨萃取前和萃取5、15和90min后 Tmp的紫外光谱图。由图5知，Tmp 在最大吸收波长217 mm处的吸光度随萃取时间而降低，萃取 图5 Tm(a)和 Tyr(b)被膨胀石墨萃取不同时间的紫外光谱图 Fig 5 UV spectra of Trp (a) and Tyr (b) extracted by expanded graphite at different time Tmp：0. 05 mmol/L； Tyr：0. 05 mmol/L；膨胀石墨用量(the amount of expanded graphite) ：0.1088 g； 萃取富集时间 (extrac-ting time) 1~4： 0，5，15，90 m in. 90min后，吸光度降低了83.1%，表明膨胀石墨对Tmp有很强的萃取富集作用。而仅用固体石蜡萃取150min后，Tmp的紫外光谱图和萃取前完全重合，这说明固体石蜡对Tm的富集作用与膨胀石墨相比很小。同时研究了膨胀石墨对 Tyr萃取前后的紫外光谱图，如图5b。萃取90min后， Tyr在最大吸收波长222 nm处的吸光度仅下降了28.2%，说明膨胀石墨对 Tyr的取取富集效果远弱于其对 Tmp的。紫外光谱结果也是3.4节DPA实验现象的一个有力证据。 膨胀石墨电极作电化学传感器，更为显著的特点是能富集Tm正离子，缩短传质过程时间。Tpp在电极表面的富集可能是3种效应的协同作用：第一种是静电吸引效应，由于富集电位-0.1V，最佳 pH 值为2.0，在此 pH下，Tmp呈正离子形式，电极和Tm正离子之间存在静电吸引；第二种是吸附效应，比表面积的测定结果证实，膨胀石墨的比表面积为41.38 m/g，远大于石墨粉的比表面积(3.36m/g)，大的比表面积使得膨胀石墨电极具有强的吸附效应；第三种是氢键效应，制备膨胀石墨过程中，使用了 HNO；和 KMnO4等强氧化剂，可能将含氧基团(如oOH、.COOH等)引到膨胀石墨上，这一假定也从天然鳞片石墨和膨胀石墨的红外光谱图得到了证实 (见图6)。天然鳞片石墨在3434 cm 处有很弱的水吸收峰，这可能是来自样品 图6天然鳞片石墨(a)和膨胀石墨(b)的红外光谱图 Fig 6 R s：pectra of natural graphite flakes (a))andexpanded graphite(b) 和用于压片的 KBr晶体中微量水分；而膨胀石墨在3444和1636cm的吸收峰均显著增强。因为两者进行红外实验时的条件完全相同，因此-OH吸收峰增强可归咎于制备膨胀石墨过程中引入的含氧基团——羟基，使Tmp通过氢键效应富集到电极表面。所以Trp在电极表面的富集是静电吸引、吸附效应和氢键效应的协同作用结果。 制备膨胀石墨过程中引入含氧基团还可以通过 XRD结果来说明(图略)。与天然鳞片石墨相相，膨胀石墨衍射峰位置不变(20=26.2°)，但强度降低，这说明天然鳞片石墨经氧化插层后，由于含氧基团的插入，使其晶体结构在一定程度上被破坏，结晶度有所下降，导致膨胀石墨的衍射峰强度降低。 在DPA实验条件下，富集于电极表面的Tm发生电化学氧化，反应过程如下： 图7 Tm在膨胀石墨电极上的 CV图 Fig7(Cyclic voltammogram s of Tip on expandedgraphite electiode 将电极置于含 2.0X10mol/L Tpp的 KC1(pH=2.0)溶液中，在0.7~1.3V范围内进行连续 CV实验。从图7可见，1.0V附近出现氧化峰，但反向扫描时无还原峰，说明电极反应过程不可逆，是典型的受吸附控制的电极反应类型；且随扫描次数增多，氧化峰电流逐渐降低，这也证实了电极反应过程受吸附控制。从图7不难判断出，在静电吸引、吸附效应和氢键效应这3种导致Tmp在 1.第一圈(the first cycle)；2.第二圈(the secondcycle)；3.第三圈(the third cycle). 电极表面富集的因素中，吸附效应是最主要的。 ( 2 Chen L C， Ho K C S ensors and Actuators B，2008， 1 30：418~424 ) ( 3 Ensafi A A， Hajian R . Anal Chim. Acta， 2006， 580：236~243 ) ( 4 Fang B， Wei Y， LiM G ， Wang G F， Z hang W.Talanta，2007，72 ： 1302~1306 ) ( 5 Saeed S hahrokhian， L eila Fotouhi Senors and Actuators B， 2007， 1 23：942~949 ) ( 6 Du Yan(杜 艳)， Yan JiL in(严吉林)， L i u Jun-Shan(刘军山)， Zhou Wei-Hong(周伟红)， Yang Xiu-Rong(杨秀荣)，W ang Er-Kang(汪尔康). ChineseJ. Ana l Chen. (分析化学)，2 0 05，3 3 (5)：591~594 ) ( 7 W isslerM. JJ . Power Sources，2006，156 ： 142~150 ) ( 8 Li Yu-Feng(李玉峰)， Liu GuoQin(刘国钦)， LaiQi(赖 奇)， Yang Jian-Song(杨健松). Chen ical Equipm ent Te c hnol ogy(化工装备技术)，2007，28：75~77 ) ( 9 Zou YongDe(邹永德)， W ang Jin(王 进)， Mo Jin-Yuan(莫金垣)， Zhang Run-Jian(张润建). J . Instrum entalAna lysis(分析测试学报)，1999， 18： 2 5~28 ) Fabrica tion of Expanded Graphite Electrode and Its Applica tionin Electrochem icalDetection of Tryptophan ZHAO Wei2， KONG Yong， KAN Jin Qing， CHEN ZhiDong*1，2 (Faculty of Chen istry and Chen ical Engineering， Jiangsu Polytechnic University， Changzhou 213164)"(Key L abora tory of Fine Petrochen icals of Jiangsu Province， Changzhou 213164) ’(Faculty of Chen istry and Chen ical Engineering，Yangzhou University， Yangzhou 225002) Abstract Expanded graphite was prepared by chem ical oxidation， and then expanded graphite electrode wasfabricated using paraffin as adhesiveThe electrode has characteristics of electrochem ical sensing ， enrichingthe molecules of analyte and shortening the tme used in mass transfer Various expermental parameters wereop tim ized to analyze tryp tophan by emp loying differential pulse stripp ing voltammetry The results of experi-ment demonstrate that the relationship between the electrode response and the concentration of tryp tophan islinear in the range of 2 0 ×10-5-1. 2 ×10 mol/L， the detection lmit is 2. 0 x10’mol/L， and the RSDis 2.4%.6.The electrode has good selectivity， other eight am ino acids ofwhich the concentrations were about100 times higher than those of tryp tophan have no response on the electrode except tyrosine The content oftryp tophan in medical am ino acid injection was detemm ined using the electrode with satisfactory resultsThereaction mechanism of tryp tophan on expanded graphite electrode surface was also discussed Keywords Expanded graphite electrode， tryp tophan， differentialpulse stripp ing voltammetry， selectivity (Received 16 May 2008； accep ted 31 August 2008) 《化学发光免疫分析》 化学发光免疫分析结合了化学发光的高灵敏度和免疫分析的高选择性，在临床检验、药物分析、环境检测等等域得到比较广泛的应用。全书分两部分：1~9章介绍化学发光免疫分析的新方法和基础理论研究；10~18章介绍化学发光免疫分析的应用和新进展，主要针对临床检测、环境分析以及食品安全的应用领域。第19章简要介绍了分析过程的质量管理与控制。附录收集了常用化学发光免疫分析方法、试剂盒，以及相关专业术语的中英文对照。 该书由清华大学林金明、赵利霞、王栩主编。作者以丰富的科研实践经验编著而成，具有较强的实用性，可作为临床分析、环境监测、检验检疫、食品卫生等部门的科研人员和分析工作者参考，也可作为大专院校和科研院所相关专业师生的教学用书。 该书由化学工业出版社出版，定价68.00元。 ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. 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