糖基化、脱酰胺、天 冬氨酸异构化中药物检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientific 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 使用High-Resolution Accurate MassMulti-Attribute Method (HR-MAM)对NIST单抗的关键质量属性进行监控 1.前言 随着治疗性生物产品在全球药物市场所占份额的不断提高，各国监管机构通过发布质量源于设计(Quality by Design， QbD)原则等手段，对生物药的质量控制提出了更高的要求。对于生物制药企业而言，在生产及批次放行过程中对关键质量属性(critical quality attribute， CQA)和杂质等进行鉴定、定量和监控就显得尤为重要。传统的质控手段包括多种分离手段，如反相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatogra-phy， RP-HPLC)、体积排阻色谱(size-exclusion chromatogra-phy， SEC)、离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEX ) 和毛细管电泳(capillary electrophoresis， CE ) 等。 2015年， Rogers等基于Orbitrap高分辨质谱平台发展了Multi-Attribute Method (MAM)，用于在一针进样中同时对CQA进行鉴定、定量和实时监控。自从MAM发布以来，获得了业界的极大关注，在近年的学术会议中屡屡成为热点议题。 在本文中，我们使用Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus Or-bitrapTM 高分辨质谱平台，串联Thermo ScientificTM VanquishTMFlex UHPLC系统， 使用Thermo ScientificTM ChromeleonTM 7.2.9Chromatography Data System (CDS) 与Thermo ScientificTM Bio-Pharma FinderTM 3.2软件进行数据采集和处理(Figure 1). Figure 1. Thermo Scientific HR MAM 工作流程图.使用BioPharma Finder软件对肽图分析的数据进行分析，与发现阶段进行对比以鉴定CQAs；随后将BioPharma Finder生成的CQA列表导出至变色龙CDS中进行常规GMP阶段符合合规要求的目标组分检测。 a.仪器及试剂 ( ·QExactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrome- ter ) ( ·Vanquish Flex UHPLC system ) ( · T hermo ScientificTM AccucoreTM VanquishTM C18+ U H PLC co-lumn， 1.5 um， 2.1×150 mm ) ( ·Thermo ScientificTM Acetonitrile， UHPLC-MS grade ) · Thermo ScientificTM PierceTM Trypsin Protease MS grade · Thermo ScientificTM PierceTM Formic Acid， LC-MS grade · InvitrogenTM UltraPureTM 1 M Tris-HCI Buffer， pH 7.5 ( ·8.0 M G u anidine Hydrochloride Solution ) ( ·Bio-Spin P-6 Gel Columns， Tri s Buffer ) ·Thermo ScientificTM Zeba Spin Desalting Columns， 0.5mL ·Sodium lodoacetate (IAC) BioUltra >98% purity ( ·DL-Dithiothreitol (DT T ) BioXtra ≥99% purity ) b.实验样品 ( NISTmAb Humanized lgG1 k M onoclonal A ntibody (NIST ， RM8671)。 ) c. 样品前处理步骤 ·商业化NIST mAb标准品以溶液形式提供，溶于 12.5 mM L-histidine + 12.5 mM L-histidine HCI (pH 6.0)体系中，浓度为10.004±0.08 mg/mL。取两份10 pL NIST mAb标准品，分别标记为RA2和RA3， 各加入90 uL Solution I(7 M Guanidine ·还原：向上述样品中分别加入2.0 uL Solution II (500 mM DTT)使DTT终浓度为10mM， 随后室温孵育30分钟。 ( ·烷基化：还原结束后，向上述样品中分别加入4.0 pL of Solu-tion Ⅲ(500 mM IAC)并用移液器充分混 合 ，使IAC终浓度为20mM， 避光室温孵育20分钟。 ) 。溶液置换：烷基化结束后，向上述样品中分别加入4.0 uLSolution Ⅳ (50 mM DTT)用于中和过量的IAC。随后分别取BioSpin-6 column和Thermo ScientificTM Zeba Spin DesaltingColumns， 0.5mL各一支，按照其说明书分别将其溶液体系置换为50 mM Tris (pH7.9)。弃去下层溶液并更换新的1.5mL外管，随后向BioSpin-6 column中加入经还原烷基化之后的RA2样品， 向Zeba Spin Desalting Column中加入经还原烷基化之后的RA3样品， 1000xg转速离心四分钟后分别收集下层溶液准备酶解。 ·酶解：使用双蒸水将Pierce Trypsin复溶为1mg/mL，温和涡旋混匀。按照酶：蛋白=1：10(w：w)的比例将胰酶溶液分别添加至前述两份NIST mAb样品中，37℃孵育30分钟，加入甲酸(终浓度为10%)终止酶解反应，随后将两份样品分别转移至样品瓶中并置于液相自动进样器里，待后续分析。 d.实验方法设置 ·液相色谱： Vanquish Flex UHPLC system ·色谱柱： Accucore Vanquish C18+ UHPLC column (1.5 um，2.1x150 mm) ·柱温：50℃(column oven Mode set to Still Air) ·自动进样器温度：5℃ ·上样量：每个样品4pL(约4pg酶解肽段) ·流动相：0.1% formic acid in water (A1) / 0.1% formic acid inacetonitrile (B1) ·流速：0.250mL/min. 液相梯度如表1所示。 B% B% B% 0 1 77 90 93 90 5 1 79 1 99 90 6 10 81 1 101 1 70 35 83.5 10 115 1 72 90 91.5 45 Table 1.液相梯度. 质谱条件如表2所示。其中用于肽图分析的数据使用Top5ddMS2 方法采集， BioPharma Finder 处理； CQA定量的数据使用Full Scan MS only 方法采集，变色龙软件处理。 Table 2.质谱条件. e.数据处理软件 使用Thermo Scientific BioPharma Finder 3.2软件进行肽图分析，参数设置如表3所示。对两份样品的MS/MS数据进行搜库，以确定用于监控和定量的CQA。 Database Parameters Glycation (K) NH3 loss (NQ) Dxidation (MW) Lys (C-term) GIn-Pyro-Glu (N-term) N， O Glycans (CHO) Table 3. Biopharma Finder 搜库条件. 参考之前的报道，在本文的研究中我们选定了如下的CQAs用于定量：糖基化(glycosylation)、脱酰胺 (deamidation)、天冬氨酸异构化 (isomerization) 和C端赖氨酸丢失(C-terminallysine truncation)。对于每个CQA，我们选取了鉴定到的每个电荷态的前四个同位素峰， 在BioPharma Finder中另存为TargetPeptide Workbook， 并一键导出为BioPharma Finder workbookfile (.wbpf)，随后将其导入变色龙 Processing Method中的 MSComponent Table。 任何新发现的CQA可以随时添加进BioPharma Finder workbook和变色龙方法中，这为方法开发和优化阶段提供了极大的灵活性。一旦在变色龙软件中建立了标准化的分析方法，即可将该方法应用于GMP环境下的应用中。 接下来，使用Chromeleon CDS 7.2.9软件进行CQA定量。我们基于变色龙软件中的MS Quantitative模板创建了MAM数据处理的方法，基本参数如表4所示。在变色龙软件中，可以对峰积分的参数进行优化，以确保积分结果一致且可信，从而得到准确的定量结果。 MS Detection Value Extracted lon Chromatogram Detection Algorithm ICIS Default Values MS Settings Value MS No. of Decimal Points 5 Mass Tolerance Manually Define Mass Toleran- ce， 8 ppm Integration Inhibit Integration for TIC Chan- nel MS Spectra Bunching No baseline correction， 1 scan Composite Scoring Value Pass Score if at Least 2 criteria passed Fail Score if Less Than 1 criterion passed Isotopic Dot Product ≥0.900 Mass Accuracy ≤5.00 ppm Peak Apex Alignment ≤0.50 min Table 4.变色龙数据处理条件. 本次实验选取的两份NIST mAb标准品来源于同一批次，通过对比不同溶液置换耗材处理后选定CQA含量的变化趋势，进而研究不同耗材对CQA定量结果的影响。图2展示了BiopharmaFinder对两个样品进行肽图分析的结果，可见在上样量约4pg肽段的情况下， NIST mAb标准品轻链覆盖度≥96%，重链覆盖度>98%，除了一些胰酶酶切过短的肽段没有鉴定到，其余区域均可鉴定到肽段信息， 为CQA的选取和定量提供了坚实的基础。 Figure 2.两份NIST mAb标准品(RA2，上； RA3，下)酶解肽段基峰谱图 (Base Peak Chromatogram). 对于两个样品，我们分别进行了三针技术重复。表5展示了对主要糖型的定量结果。由图中可以看出，分别使用不同前处理耗材的两个样品的六针进样之间均呈现良好的重现性。 Injection A2G0F(%) A2G1F(%) A2G2F(%) A1G0F(%) A1G1F(%) A1G0(%) M5(%) Unglycosyla- ted(%) 190517_NIST_RA2_1_MS 40.52 39.72 9.55 4.17 3.39 0.68 1.15 0.83 190517NIST RA2 2 MS 40.25 39.99 9.62 4.18 3.38 0.63 1.12 0.83 190517NIST_RA2_3_MS 39.95 40.38 9.54 4.23 3.38 0.63 1.09 0.81 190517 NIST RA3 1 MS 40.16 40.37 9.54 4.21 3.32 0.59 1.08 0.74 190517 NIST RA3 2MS 40.53 40.10 9.33 4.27 3.34 0.60 1.06 0.77 190517 NIST RA3 3 MS 40.60 40.05 9.29 4.19 3.34 0.63 1.08 0.81 avg 40.34 40.10 9.48 4.21 3.36 0.62 1.10 0.80 SDTEV 0.24% 0.23% 0.12% 0.03% 0.03% 0.03% 0.03% 0.03% CV 0.59% 0.57% 1.29% 0.77% 0.77% 4.35% 2.81% 4.31% 图3A展示了肽段FNWYVDGVEVHNAK上D283的异构化比率和N289的脱酰胺比率。由图中不难发现，两种不同溶液置换条件下天冬氨酸异构化和脱酰胺化比率并没有显著差异，表明对于这两种修饰，使用不同溶液置换耗材也无显著差异。 以RA2样品为例，进一步观察发生天冬氨酸异构化和未修饰峰的对比，可见由于修饰/未修饰肽段色谱保留时间的差异，可以将其分离开，在变色龙软件中按照保留时间差异进行相应设置，分别提峰进行相对定量(图3B)；得益于Orbitrap质谱的高灵敏度，相对含量只有未修饰峰约0.15%的异构化峰也可以检测到高质量的一级质谱图和准确的肽段同位素峰分布(图3C-F)。 Figure 3A. 肽段FNWYVDGVEVHNAK上D283的异构化比率和N289的脱酰胺比率对比。 Figure 3B. RA2样品中肽段FNWYVDGVEVHNAK发生/未发生天冬氨酸异构化XIC峰的对比。 Figure 3C-F. 两个样品中肽段FNWYVDGVEVHNAK发生/未发生天冬氨酸异构化一级质谱峰及肽段同位素峰分布。3C，肽段FNWYVDGVEVHNAK理论与实测同位素峰分布。3D，肽段FNWYVDGVEVHNAK一级质谱峰。3E， 肽段FNWYVD[iso]GVEVHNAK理论与实测同位素峰分布。3F，肽段FNWYVD[iso]GVEVHNAK一级质谱峰。 热线800 8105118 电话4006505118 www.thermofisher.com 表6展示了重链末端修饰的定量结果。可见对于重链C端的赖氨酸丢失，即使采用了不同的前处理耗材，样品之间修饰的定量CV仍可保持在较低水平。 Injection Name MS Quantitation Lys Clipping(%) 190517_NIST_RA2_1_MS 89.148 190517_NIST_RA2_2_MS 89.150 190517 NIST RA2 3 MS 89.150 190517_NIST_RA3_1_MS 88.782 190517_NIST_RA3_2_MS 88.332 190517NIST RA3 3 MS 89.006 Average 88.928 STDEV 0.325 CV 0.37% Table 6.重链C端赖氨酸丢失定量结果. 4.结论 在本实验中，我们使用基于Thermo高分辨质谱平台的HR-MAM流程对在前处理步骤中使用不同溶液置换耗材的NIST mAb标准品进行了CQA的鉴定和定量。得益于HR-MAM流程的稳健性、灵活性、特异性和高灵敏度，我们可以在一次实验中同时对多个CQA进行监控和定量。 对比不同溶剂交换前处理耗材的实验结果，可发现肽图强度、色谱峰型及分离与肽图覆盖度等无明显差异，且与关键质量属性相关的特定修饰，使用不同耗材处理得到的定量比率并无显著区别， 更进一步证明了HR-MAM流程的稳定性。 ( 1. Rogers， R .， et al. Development o f a quantitative m ass spectro-metry m ulti-attribute ) ( method for characterization， quality control testing and dispositionof biologics. MAbs，2015， 7，881. ) ( 2. Rogers， R.， et al. A view on t h e importance of “multi-attributemethod” for measuring pu r ity of b i opharmaceuticals and im - proving overall control strategy. T h e AAPS Journal，2018，20， 7. ) 在本实验中，我们使用基于Thermo高分辨质谱平台的HR-MAM流程对在前处理步骤中使用不同溶液置换耗材的NIST mAb标准品进行了CQA的鉴定和定量。得益于HR-MAM流程的稳健性、灵活性、特异性和高灵敏度，我们可以在一次实验中同时对多个CQA进行监控和定量。对比不同溶剂交换前处理耗材的实验结果，可发现肽图强度、色谱峰型及分离与肽图覆盖度等无明显差异，且与关键质量属性相关的特定修饰，使用不同耗材处理得到的定量比率并无显著区别，更进一步证明了HR-MAM流程的稳定性。