mAb 标准品和 HeLa 细胞膜富集提取物中高荷质比多肽离子检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

LC/MS/MS系统 Linfeng Wu、 Christine A. Miller、Jordy Hsiao、 Te-wei Chu、Behrooz Zekavat 和 Anabel Fandino 应用具有扩展质量数范围的三重四极杆质谱仪对高质荷比多肽离子进行常规分析 应用简报靶向蛋白质组学 前言 使用液相色谱/三重四极杆质谱仪对蛋白质进行常规的高通量定量分析时，我们将多肽作为相应蛋白质的替代物。选择独特的多肽以及适合每种目标多肽的MRM 离子对是分析成功的关键步骤。考虑到仪器质量数范围限制，分析时通常不会选择具有高 m/z 母离子或子离子的多肽。但是，若要解决生物学问题，此类多肽也许能提供关键信息，甚至可能是唯一的分析选择。此类例子包括具有大型疏水性跨膜结构域的膜蛋白、带有多种翻译后修饰结构的蛋白质，以及内源性多肽等等。 本应用简报将介绍 Agilent 6495B 三重四极杆质谱仪分析具有高 m/z 子离子的多肽的性能，并展示将分析的质量数范围扩展至 m/z 3000 带来的优势。将胰蛋白酶消解的单克隆抗体(mAb)标准品和 HeLa 膜胞膜富集提取物分别作为简单样品和复杂样品进行分析。 实验方法蛋白质/多肽选择 使用 Agilent 6550 Q-TOF质谱仪，在数据依赖型模式下采集抗 IL8mAb 消解物和 HeLa 细胞膜富集蛋白质消解物的 LC/MS数据。使用 Agilent SpectrumMill (B.05.00.181 SP1版)比对适用的数据库检索原始数据，鉴定出产生高m/z 子离子的多肽，以此测试 Agilent6495B三重四极杆质谱仪的性能。 将 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系统连接至质量数范围达 3000 u 的6495B三重四极杆质谱仪。LC/MS实验采用安捷伦喷射流(AJS) 离子源和 AgilentPoroshell 120 EC-C18， 2.1×100 mm 2.7 pm色谱普(部件号695775-902)井行。使用3.5分钟的 MRM 方法分析mAb消解物， HeLa 细胞膜消解物则使用21分钟的 MRM 方法分析。 表1. Agilent 6495 三重四极杆 MS 方法 参数 设置 电离模式 AJS， 正离子 干燥气温度 150°C 干燥气流速 15 L/min 雾化器压力 30 psi 鞘气温度 200°C 鞘气流速 11 L/min 毛细管电压 3500V 喷嘴电压 0V 高/低压力RF 电压 200/110V Delta EMV 100-200 V 01和Q3分辨率 峰宽/单位 碎裂电压 380V 碰撞池加速器电压 4V 循环时间 267-369 ms 表2.选择用于LC/MS/MS 测试的多肽和离子 蛋白质名称 多肽 修饰 m/z 母离子 m/z MRM 定量离子 m/z MRM 定性离子 抗 IL8 mAb 抗体 EEQYN[+1606.6]STYR N-糖链 G1F 932.7 204.1 366.1 1392.6 2065.8 2227.9 固醇0-酰基转移酶1 SSTVPIPTVNQYLYFLFAPTLIYR 无 1402.3 1215.2 762.5 1110.1 2219.2 2429.3 线粒体 ATP 合酶亚基d NLIPFDQMTIEDLNEAFPETK 无 1233.1 1063.0 228.1 341.2 474.3 2125.0 ADP/ATP转位酶1 YFAGNLASGGAAGATSLC[+57FVYPLDFAR 脲甲基化 1398.7 718.4 175.1 881.5 1915.9 2060.0 制备 mAb 消解物的稀释系列，并将每个进样浓度的信号响应相对于mAb 消解物的总柱上进样量作图，据此进行糖肽定量分析。 此外，通过将每种子离子的信号响应相对于对应的柱上进样量作图，执行HeLa 细胞膜多肽的定量分析。 多肽鉴定和选择 采用抗 IL8 mAb 消解物和 HeLa 细胞膜消解物开发多肽鉴定和MRM 方法，所得结果如下： 选择来自 mAb 消解物的一种 G1FN-糖肽和来自 HeLa 细胞膜消解物的三种多肽(子离子质量数范围为 m/z 204.1至 m/z 2429.3) 进行 LC/MS/MS测试(表2) 。 图1和图2显示了其中两种多肽的MS/MS 谱图和优化的 MRM 色谱图。MS/MS图中用*标记出了为 MRM方法选择的子离子。 糖肽会产生具有大型多糖链的高 m/z子离子，这些子离子能够为多糖的结构解析提供丰富信息。 ( 在复杂样品中，具有较高 m/z的子离子往往背景噪音更低或者信噪比更高。 ) 图1. G1F糖肽 EEQYN[+1606.6]STYR 的 MS/MS 谱图和优化的 MRM 色谱图 4 图2.多肽 SSTVPIPTVNQYLYFLFAPTLIYR 的 MS/MS 谱图和优化的 MRM 色谱图 使用配备安捷伦喷射流技术的 Agilent1290 Infinity UHPLC 系统和质量数范围达3000 u 的 6495B三重四极杆液质联用系统执行糖肽定量分析，所得结果如下(图3)： 所有浓度的进样都表现出优异的精度和准确度， mAb 消解物柱上总进样量低至0.0197 ng(130amol)的进样也不例外 (RSD为18.5%， 准确度为97.5%)。目标多肽据估计约占总蛋白质的10%，因此糖肽的 LOQ约为柱上13 amol 子离子的响应可重现，且具有扩展的质量数范围 (m/z 204.1-m/z2227.9) 保留时间 (RT)重现性非常出色(n=90时，RSD%=0.47%) 在倍数变化较小的低进样水平下表现出优异的线性 (0.0197ng-19.7 ng， R²=0.998) ×102 A B -1 0 2 3 4 5 6 8 910 11 12 1314151661177 11881192021 浓度(ng， 柱上mAb 消解物) 图3. G1F 糖肽 EEQYN[+1606.6]STYR 的定量分析 HeLa 细胞膜多肽定量 按照与糖肽相同的方案定量来自 HeLa细胞膜富集样品消解物的三种多肽，以测试高m/z 子离子的行为(图4)。 由于样品中这些肽的化学计量学特征未知，我们将三种多肽的定量离子响应相对于其对应的柱上进样量作图(左图) 可以观察到良好的线性(R²范围为0.989至0.997) 可以观察到可重现的子离子响应，且具有扩展的质量数范围(上限为m/z 2429.3，右图) 结论 Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统的质量数范围达3000u， 在检测高m/z多肽离子时非常有用。相较于低m/z的母离子或子离子，使用高m/z 母离子或子离子的优势之一是这些离子的背景噪音更低，尤其是在复杂的消解物样品中。某些高 m/z 子离子可提供重要的生物学信息，例如翻译后修饰(如糖基化)的位点和结构大小。 本应用简报展示了 Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统分析高m/z子离子的 MRM 离子对时优异的重现性。本文所述的研究采用安捷伦喷射流技术在标准流速下进行，糖肽和 HeLa 细胞膜多肽的定量结果均表现出优异的精密度和准确性。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 仅限研究使用。不可用于诊断目的。 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科技(中国)有限公司，2016 2016年11月30日，中国出版 5991-7298CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies     前言    使用液相色谱/三重四极杆质谱仪对蛋白质进行常规的高通量定量分析时，我们将多肽作为相应蛋白质的替代物。选择独特的多肽以及适合每种目标多肽的MRM 离子对是分析成功的关键步骤。考虑到仪器质量数范围限制，分析时通常不会选择具有高 m/z 母离子或子离子的多肽。但是，若要解决生物学问题，此类多肽也许能提供关键信息，甚至可能是唯一的分析选择。此类例子包括具有大型疏水性跨膜结构域的膜蛋白、带有多种翻译后修饰结构的蛋白质，以及内源性多肽等等。    本应用简报将介绍 Agilent 6495B 三重四极杆质谱仪分析具有高 m/z 子离子的多肽的性能，并展示将分析的质量数范围扩展至 m/z 3000 带来的优势。将胰蛋白酶消解的单克隆抗体 (mAb) 标准品和 HeLa 细胞膜富集提取物分别作为简单样品和复杂样品进行分析。    结论    Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统的质量数范围达 3000 u，在检测高 m/z多肽离子时非常有用。相较于低 m/z的母离子或子离子，使用高 m/z 母离子或子离子的优势之一是这些离子的背景噪音更低，尤其是在复杂的消解物样品中。某些高 m/z 子离子可提供重要的生物学信息，例如翻译后修饰（ 如糖基化）的位点和结构大小。本应用简报展示了 Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统分析高 m/z 子离子的 MRM 离子对时优异的重现性。本文所述的研究采用安捷伦喷射流技术在标准流速下进行，糖肽和 HeLa 细胞膜多肽的定量结果均表现出优异的精密度和准确性