食品中脂肪检测方案(抽提萃取)

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索氏提取脂肪测定仪之重量分析法-脂肪的测定 1概述 食品中的脂类主要包括脂肪(甘油三酸脂)和一些类脂质，如脂肪酸、磷脂、糖脂、甾醇、固醇等，大多数动物性食品及某些植物性食品(如种子、果实、果仁)都含有天然脂肪或类脂化合物。 各种食品含脂量各不相同，其中植物性或动物性油脂中脂肪含量最高，而水果蔬菜中脂肪含量很低。 (1)脂肪在食品与食品加工中的作用 脂肪是食品中重要的营养成分之一。 脂肪可为人体提供必需脂肪酸。脂肪是一种富含热能营养素，是人体热能的主要来源。脂肪是脂溶性维生素的良好溶剂，有助于脂溶性维生素的吸收。 脂肪与蛋白质结合生成脂蛋白，在调节人体生理机能和完成体内生化反应方面都起着十分重要的作用。 在食品加工过程中，原料、半成品、成品的脂类含量对产品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接的影响。蔬菜本身的脂肪含量较底，在生产蔬菜罐头时，添加适量的脂肪可以改善产品的风味，对于食品面包之类焙烤食品，脂肪含量特别是卵磷脂组分，对于面包心的柔软度、面包的体积及其结构都有影响。 因此，在含脂肪的食品中，其含量都有一定的规定，是食品质量量理中的一I项重要指标。测定食品的脂肪含量，可以用来评价食品的品质，衡量食品的营养价值，而且对实行工艺监督，生产过程的质量管理，研究食品的储藏方式是否恰当等方面都有重要的意义。 (2)食品中脂肪存在形式 食品中脂肪有游离态存在形式的，如动物性脂肪及植物性油脂；也有结合态的，如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工品(如焙烤食品及麦乳精等)中的脂肪，与蛋白质或碳水化合物形成结合态。 对大多数食品来说，游离态脂肪是主要的，结合态脂肪含量较少。 脂类的共同特点是在水中的溶解度非常小，能溶于脂肪溶剂中，再根据相似相溶的规律具体选择。 (3)脂类的提取 常用测定脂类的有机溶剂有： ①乙醚 有一定极性，但不如乙醇、甲醇、水等溶解脂肪的能力强，应用最多。GB 中关于脂脂含量的测定都采用它作提取剂。 乙醚沸点低(34.6℃)，易燃。乙醚可饱和2%的水。含水乙醚在萃取脂肪的同时，会抽提出糖分等非脂成分。所以必须用无水乙醚作提取剂，被测样品也要事先烘干。 ②石油醚 石油醚的沸点比乙醚高，不太易燃，溶解脂肪能力比乙醚弱，吸收水分比乙醚少，允许样品含微量的水分。石油醚溶解脂肪的能力比乙醚弱些，但吸收水分比乙醚少，没有乙醚易燃，使用时允许样品含有微量水分，这两种溶液只能直接提取游离的脂肪，对于结合态脂类，必须预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。 因二者各有特点，故常常混合使用。但乙醚、石油醚都只能提取样品中游离态的脂肪。对于结合态的脂类，必须预先用酸或碱及乙醇破坏脂类与非脂类的结合后，才能提取。 3.氯仿-甲醇 2)样品要干燥 温度低——酶活力高，脂肪易降解。 温度高——脂肪易氧化成结合态。 较理想的方法是冷冻干燥法。 3)酸水解：对于乙醚不能渗入内部的或含结合态脂肪。 用溶剂提取食品中的脂类时，要根据食品种类、性状及所选取的分析方法，在测定之前对样品进行预处理。有时需将样品粉碎、切碎、碾磨等；有时需将样品烘干；有的样品易结块，可加入4-6倍量的海砂；有的样品含水量较高，可加入适量无水硫酸钠，使样品成粒状。以上的处理目的都是为了增加样品的表面积，减少样品含水量，使有机溶剂更有效的提取出脂类。 2常用的测定脂类的方法 常用的测定脂肪的方法有：索氏提取法、酸分解法、罗斯-哥特里法、巴布科克氏法、盖勃氏法和氯仿-甲醇提取法等。酸水解法能对包括结合态脂类在内的全部脂类进行定量。 而罗斯-哥特里法主要用于乳及乳制品中脂类的测定。 2.1 JTONE 索氏提取法 (1)原理 将经前处理而分散且干燥的样品用无水乙醚或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，，t即为脂肪(或粗脂肪)。 一般食品用有机溶剂浸提，挥干有机溶剂后得到的重量主要是游离脂肪，此外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质，所以用索氏提取法测得的脂肪，也称粗脂肪。 (2)适用范围与特点 此法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。索氏提取法测得的只是游离态脂肪，而结合态脂肪测不出来。 此法经典，对大多数样品的测定结果比较可靠。但费时长(8-16h)溶剂用量大，需要专门的仪器，索氏提取器。 (3)仪器 ①索氏提取器 ②电热恒温水浴(50~80℃) ③电热恒温烘箱(80~120℃) (4)试剂 无水乙醚或石油醚 (5)测定方法 滤纸筒的制备→样品制备一索氏提取器的准备→抽提→回收溶剂 将滤纸裁成 8cm×15cm大小，以直径位 2.0cm 的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在100~105℃烘箱中烘至恒量(准确至0.0002g) ①D 滤纸筒的制备 固体样品：精密称取干燥并研细的样品2~5g(可取测定水分后的样品)，必要时拌以海砂，无损地移入滤纸筒内。 半固体或液液样品：称取5.0-10.0g于蒸发皿中，加入海砂约20g于沸水浴上蒸干后，再于 95-105℃烘干、研细，全部移入滤纸筒内，蒸发皿及粘附有样品的玻璃棒都用沾有乙醚的脱脂棉擦净，将棉花一同放进滤纸筒内。 ② 样品处理 索氏抽提取器是由回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒量。 ③聚同电子索氏抽提取器的准备 将滤纸筒或滤纸包放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚(30-60℃沸程)，加量为接受瓶的2/3体积，于水浴上(夏天65℃，冬天80℃左右)加热使乙醚或石油醚不断的回流提取，控制每分钟滴下乙醚80滴左右，抽提3-4h至抽提完全(视含油量高低，或8-12h， 甚至24h)。可用滤纸或毛玻璃检查，由提脂管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下下迹。 ④抽提 ⑤回收溶剂 ◇> ⑥称重 取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚，当乙醚在提脂管内将虹吸时立即取下提脂管，将其下口放到盛乙醚的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙醚即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙醚完全蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残留乙醚。用纱布擦净烧瓶外部，于100~105℃烘箱中烘至恒量并准确称量。或将滤纸筒置于小烧杯内，挥干乙醚，在100~105℃烘箱中烘至恒量，滤纸筒及样品所减少的质量即为脂肪质量。所用滤纸应事先用乙醚浸泡挥干处理，滤纸筒应预先恒量。 ②对含多量糖及糊精的样品，要先以冷水使糖及糊精溶解，经过滤除去，将残渣连同滤纸一起烘干，再一起放入抽提管中。 ③抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。 ④提取时水浴温度不可过高，以每分钟从冷凝管滴下80滴左右，每小时回流6-12次为 宜，提取过程应注意防火。 ⑤在抽提时，冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样，可防止空气中水分进入，也可避免乙醚挥发在空气中，如无此装置可塞一团干燥的脱脂棉球。 ⑥抽提是否完全，可凭经验，也可用滤纸或毛玻璃检查，由抽提管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下油迹表明已抽提完全。 ⑦在挥发乙醚或石油醚时，切忌用直接火加热，应该用电热套，电水浴等。烘前应驱除全部残余的乙醚，因乙醚稍有残留，放入烘箱时，有发生爆炸的危险。 ⑧反复加热会因脂类氧化而增重。重量增加时，以增重前的重量作为恒重。 ⑨因为乙醚是麻醉剂，要注意室内通风。 2.2 聚同电子酸分解法 某些食品中，脂肪被包含在食品组织内部，或与食品成分结合而成结合态脂类，如，谷物等淀粉颗粒中的脂类，面条、焙烤食品等组织中包含的脂类，用索氏提取法不能完全提取出来。这种情况下，必须要用强酸将淀粉、蛋白质、纤维素水解，使脂类游离出来，再用有机溶剂提取。 此法使用于各类食品总脂肪的测定，特别对于易吸潮，结块，难以干燥的食品应用本法测定效果较好，但此法不宜用高糖类食品，因糖类食品遇强酸易炭化而影响测定效果。 应用此法，脂类中的磷脂，在水解条件下将几乎完全分解为脂肪酸及碱，当用于测定含大量磷脂的食品时，测定值将偏低。故对于含较多磷脂的蛋及其制品，鱼类及其制品，不适宜用此法。 (一)原理 将试祥与盐酸溶液一同加热进行水解，使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来，再用乙醚和石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的重量即为脂肪含量。 (二))适用范围与特点 此法适用于各类、各种状态的食品中脂肪测定。特别是加工后的混合食食，易吸湿，不好烘干的，用索氏提取法不行的样品，效果更好。 本法不适于测定含磷脂高的食品、如：鱼、贝、蛋品等。因为在盐酸加热时，磷脂几乎完全分解为脂肪酸和碱，当只测定前者时，使测定值偏低。本法也不适于测定含糖高的食品，因糖类遇强酸易炭化而影响测定。 (1) JTONE 仪器 ①恒温水浴50~80℃ ② 100ml具塞量筒 (2) 试剂 ①乙醇(95%体积分数) ②乙醚(不含过氧化物) ③ 石油醚(30~600C沸腾) 盐酸 (3)聚同电子测定步骤 ① 水解：准确确取固体样品 2g于50ml大试管中，加入8mL水，用玻璃棒充分混合，加10ml盐酸。或称取液体样品 10g于50mL大大管中，加10mL 盐酸。混匀后于70~80℃的水浴中，每隔5~10min 用玻璃棒搅拌一次至脂肪游离为止，约须40~50min，取出静置，冷却。 ② 提取：取出试管加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL 具塞筒中，用25mL 乙醚分次洗洗试管，洗液一并倒入具塞量筒内。加塞振摇 1min， 将塞子慢慢转动放出气体，再塞好，静置 15min， 小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置10~20min，待上部液体清晰，吸出上层清夜于已恒量的锥形瓶内，再加入5ml乙醚于具塞量筒内振摇，静置后仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。将锥形瓶于水浴上蒸干，置95~105℃烘箱中干燥2h，取出放干燥器中冷却30min 后称量 ②挥干溶剂后残留物中若有黑色焦油状杂质，是分解物与水一同混入所致，会使测定值增大造成误差，可用等量的乙醚及石油醚溶解后，过滤，再次进行挥干溶剂的操作。 ③若无分解液等杂质混入，通常干燥2h即可恒量。 2.3氯仿-甲醇提取法 索氏提取法对包含在组织内部的脂肪等不能完全提取出来，酸分解法常使磷脂分接而损失。而在一定的水分存在下，极性的甲醇及非极性的氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此法对于高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为 有效。 (1)原理 氯仿-甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿-甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，氯仿-甲醇混合液与一定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合态脂类游离出来的同时与磷脂等极性脂类的亲合性增大，从而有效地提取出全部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚提取，定量。 (2)仪器 ①具塞三角瓶 ②电热恒温水浴：50~100℃ ③提取装置 ④布氏漏斗 ⑤具塞离心管 ⑥离心机：：3000r/min (3)试剂 ①氯仿：97%(体积分数)以上。 ②甲醇：96%(体积分数)以上。 ③ 氯仿甲醇混合液：按2：1体积比混合。 ④石油醚。 ⑤无水硫酸钠：以120~135℃干燥1~2h。 (4)操作步骤 ①提取 准确称取均匀样品5g于具塞三角瓶内(高水分食品可加适量硅藻土使其分散)，加入60mL氯仿-甲醇混合液(对于干燥食品，可加入2~3mL水)。连接提取装置，于650C水浴中，由轻微沸腾开始，加热1h 进行提取。 ②回收溶剂 提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿-甲醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中试样残渣，滤液、洗涤液一并收集于具塞三角瓶内，置65~700C 水浴中回收溶剂，至烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。 ③石油醚萃取、定量 用移液管加入25ml石油醚，然后加入 15g无水硫酸钠，立即加塞混摇1min ，将醚层 移入具塞离心沉淀管进行离心分离(3000r/min) 5min.用 10mL 移液管加入迅速吸取离心管中澄清的石油醚 10mL，于已称量至量量的干燥称量瓶内，蒸发去除石油醚，，于100~105℃烘箱中烘至恒量(约30 min )。 (5)结果计算 2.4罗斯·哥特里法 此法为国际标准化组织(ISO)， 联合国粮农组织/世界卫生组织 (FAO/WHO)等采用，为乳、炼乳、奶粉、奶油等脂类定量的国际标准法。它适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)、各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加工成乳状的食品。 (一)原理 利用氨-乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜使非脂成分溶解于氨-乙醇溶液中，而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂肪。 (二)适用范围与特点 本法适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)，各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。 (三)测定方法 取一定量样品于抽脂瓶中，分别加入氨水，乙醇，乙醚，石油醚，充分摇匀，待上层液澄清时。读取醚层体积，放出一定体积醚层于一已值重的烧瓶中，蒸馏回收乙醚和石油醚，烘干至恒重，称重。 2.5巴布科克法和盖勃法 (一)原理 用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。 (二)适应范围与特点 这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法，适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品(如甜炼乳、加糖乳粉等)，采用此方法时糖易焦化，使结果果差较大，故不适宜。 此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。 (三)测定方法 精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶颈缓缓注入 瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约1000r/min 的速度离心5min，取出，加入80°℃以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入80°℃以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置55~60°C水溶中， 5min 后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。 )说明及讨论 ①硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。 ②硫酸除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。 ③盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的表面张力，，以利于形成连续的脂肪层。 ④加热(65~70°C水浴)和离心的目的是促使脂肪离析。。 ⑤巴布科克法中采用 17.6ml标准吸管取样，实际上注入巴氏瓶中的样品只有 17.5ml，牛乳的相对密度为1.03，故样品重量为 17.5×1.03=18g。巴氏瓶颈的刻度(0~10%)共10个大格，每大格格积为0.2ml，在60°℃左右，脂肪的平均相对密度为0.9，故当整个刻度部分充满脂脂时，其脂肪重量为0.2×10×0.9=1.8g。18g样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪。故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。 ⑥每组样品只取两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必须对称放置。 ⑦硫酸的浓度和用量必须严格按照规定，沿瓶壁缓慢加入，回旋摇动，使充分混合，否则易时脂肪层产生黑色块粒。 补充： 食用油脂几项理化特性的测定 一、酸价的测定 酸价——中和1g油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量(mg)。 酸价是反映油脂酸败的主要指标。 二、碘价的测定 碘价(碘值)——100g油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算成碘的质量(g)。 碘价在一定范围内反映油脂的不饱和程度。 三、过氧化值的测定 过氧化值——滴定 1g 油脂所需用(0.002 mol/L ) Na2S20s 标准溶液的体积(mL)。 过氧化值的大小是反映油脂是否新鲜及酸败的程度。 四、皂化价的测定 皂化价—―中和1g油脂中的全部脂肪酸(游离+结合的)所需氢氧化钾的质量(mg)。皂化价可对油脂的种类和纯度进行鉴定。 五、羰基价的测定 用羰基价来评价油脂中氧化物的含量和酸败程度。 总羰基价·个——用比色法测定。 思考题 1、脂类测定提取剂的种类、优缺点。 2、索氏提取法的原理、方法、注意事项。 3、乳脂肪的测定方法有哪几种? 4、食用油特性(酸价、碘价、氧化值、过氧化值、皂化价、羰基价)的定义。 参考资料：杭州聚同电子有限公司 索氏提取脂肪测定仪之重量分析法——脂肪的测定1概述食品中的脂类主要包括脂肪（甘油三酸脂）和一些类脂质，如脂肪酸、磷脂、糖脂、甾醇、固醇等，大多数动物性食品及某些植物性食品（如种子、果实、果仁）都含有天然脂肪或类脂化合物。       各种食品含脂量各不相同，其中植物性或动物性油脂中脂肪含量最高，而水果蔬菜中脂肪含量很低。（1）脂肪在食品与食品加工中的作用脂肪是食品中重要的营养成分之一。    脂肪可为人体提供必需脂肪酸。脂肪是一种富含热能营养素，是人体热能的主要来源。    脂肪是脂溶性维生素的良好溶剂，有助于脂溶性维生素的吸收。    脂肪与蛋白质结合生成脂蛋白，在调节人体生理机能和完成体内生化反应方面都起着十分重要的作用。    在食品加工过程中，原料、半成品、成品的脂类含量对产品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接的影响。蔬菜本身的脂肪含量较底，在生产蔬菜罐头时，添加适量的脂肪可以改善产品的风味，对于食品面包之类焙烤食品，脂肪含量特别是卵磷脂组分，对于面包心的柔软度、面包的体积及其结构都有影响。因此，在含脂肪的食品中，其含量都有一定的规定，是食品质量管理中的一项重要指标。测定食品的脂肪含量，可以用来评价食品的品质，衡量食品的营养价值，而且对实行工艺监督，生产过程的质量管理，研究食品的储藏方式是否恰当等方面都有重要的意义。（2）食品中脂肪存在形式    食品中脂肪有游离态存在形式的，如动物性脂肪及植物性油脂；也有结合态的，如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工品（如焙烤食品及麦乳精等）中的脂肪，与蛋白质或碳水化合物形成结合态。    对大多数食品来说，游离态脂肪是主要的，结合态脂肪含量较少。脂类的共同特点是在水中的溶解度非常小，能溶于脂肪溶剂中，再根据相似相溶的规律具体选择。（3）脂类的提取常用测定脂类的有机溶剂有：     ①乙醚    有一定极性，但不如乙醇、甲醇、水等溶解脂肪的能力强，应用最多。GB中关于脂肪含量的测定都采用它作提取剂。    乙醚沸点低（34.6℃），易燃。乙醚可饱和2%的水。含水乙醚在萃取脂肪的同时，会抽提出糖分等非脂成分。所以必须用无水乙醚作提取剂，被测样品也要事先烘干。    ②石油醚    石油醚的沸点比乙醚高，不太易燃，溶解脂肪能力比乙醚弱，吸收水分比乙醚少，允许样品含微量的水分。石油醚溶解脂肪的能力比乙醚弱些，但吸收水分比乙醚少，没有乙醚易燃，使用时允许样品含有微量水分，这两种溶液只能直接提取游离的脂肪，对于结合态脂类，必须预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。    因二者各有特点，故常常混合使用。但乙醚、石油醚都只能提取样品中游离态的脂肪。对于结合态的脂类，必须预先用酸或碱及乙醇破坏脂类与非脂类的结合后，才能提取。          3. 氯仿-甲醇    一种有效的溶剂，对脂蛋白、磷脂提取效率较高。特别适用于水产品、家禽、蛋制品中脂肪的提取。样品的预处理1）固体样品要粉碎，颗粒大小要合适，注意粉碎过程中的温度，防止脂肪氧化。2）样品要干燥    温度低——酶活力高，脂肪易降解。    温度高——脂肪易氧化成结合态。    较理想的方法是冷冻干燥法。3）酸水解：对于乙醚不能渗入内部的或含结合态脂肪。    用溶剂提取食品中的脂类时，要根据食品种类、性状及所选取的分析方法，在测定之前对样品进行预处理。有时需将样品粉碎、切碎、碾磨等；有时需将样品烘干；有的样品易结块，可加入4-6倍量的海砂；有的样品含水量较高，可加入适量无水硫酸钠,使样品成粒状。以上的处理目的都是为了增加样品的表面积，减少样品含水量，使有机溶剂更有效的提取出脂类。2 常用的测定脂类的方法    常用的测定脂肪的方法有：索氏提取法、酸分解法、罗斯-哥特里法、巴布科克氏法、盖勃氏法和氯仿-甲醇提取法等。酸水解法能对包括结合态脂类在内的 全部脂类进行定量。而罗斯-哥特里法主要用于乳及乳制品中脂类的测定。2.1  JTONE索氏提取法    (1) 原理    将经前处理而分散且干燥的样品用无水乙醚或石油醚等溶剂回流提取，使样品中的脂肪进入溶剂中，回收溶剂后所得到的残留物，即为脂肪（或粗脂肪）。    一般食品用有机溶剂浸提，挥干有机溶剂后得到的重量主要是游离脂肪，此外，还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质，所以用索氏提取法测得的脂肪，也称粗脂肪。    (2) 适用范围与特点    此法适用于脂类含量较高，结合态的脂类含量较少，能烘干磨细，不易吸湿结块的样品的测定。索氏提取法测得的只是游离态脂肪，而结合态脂肪测不出来。    此法经典，对大多数样品的测定结果比较可靠。但费时长（8-16 h）溶剂用量大，需要专门的仪器,索氏提取器。(3) 仪器①索氏提取器②电热恒温水浴（50~80℃）③电热恒温烘箱（80~120℃）    (4) 试剂     无水乙醚或石油醚     (5) 测定方法滤纸筒的制备→样品制备→索氏提取器的准备→抽提→回收溶剂    将滤纸裁成8cm×15cm大小，以直径位 2.0cm 的大试管为模型，将滤纸紧靠试管壁卷成圆筒型，把底端封口，内放一小片脱脂棉，用白细线扎好定型，在100~105℃烘箱中烘至恒量（准确至0.0002g）。①  滤纸筒的制备    固体样品：精密称取干燥并研细的样品 2～5g（可取测定水分后的样品)，必要时拌以海砂，无损地移入滤纸筒内。    半固体或液体样品：称取 5.0-10.0g 于蒸发皿中，加入海砂约 20g 于沸水浴上蒸干后，再于95-105℃烘干、研细，全部移入滤纸筒内，蒸发皿及粘附有样品的玻璃棒都用沾有乙醚的脱脂棉擦净，将棉花一同放进滤纸筒内。② 样品处理    索氏抽提取器是由回流冷凝管、提脂管、提脂烧瓶三部分所组成，抽提脂肪之前应将各部分洗涤干净并干燥，提脂烧瓶需烘干并称至恒量。③聚同电子索氏抽提取器的准备    将滤纸筒或滤纸包放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚（30-60℃沸程） ，加量为接受瓶的2／3体积，于水浴上(夏天65℃，冬天80℃左右)加热使乙醚或石油醚不断的回流提取，控制每分钟滴下乙醚80滴左右，抽提3-4h至抽提完全（视含油量高低，或8-12h，甚至24h）。可用滤纸或毛玻璃检查，由提脂管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下痕迹。④抽提    ⑤ 回收溶剂    ⑥ 称重    取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚，当乙醚在提脂管内将虹吸时立即取下提脂管，将其下口放到盛乙醚的试剂瓶口，使之倾斜，使液面超过虹吸管，乙醚即经虹吸管流入瓶内。按同法继续回收，将乙醚完全蒸出后，取下提脂烧瓶，于水浴上蒸去残留乙醚。用纱布擦净烧瓶外部，于100~105℃烘箱中烘至恒量并准确称量。或将滤纸筒置于小烧杯内，挥干乙醚，在100 ~105 ℃烘箱中烘至恒量，滤纸筒及样品所减少的质量即为脂肪质量。所用滤纸应事先用乙醚浸泡挥干处理，滤纸筒应预先恒量。(6) 结果计算(7)  JTONE注意及说明    ① 样品应干燥后研细，样品含水分会影响溶剂提取效果，而且溶剂会吸收样品中的水分造成非脂成分溶出。装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，也但不要包得太贤影响镕剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。    ② 对含多量糖及糊精的样品，要先以冷水使糖及糊精溶解，经过滤除去，将残渣连同滤纸一起烘干，再一起放入抽提管中。    ③ 抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。    ④提取时水浴温度不可过高，以每分钟从冷凝管滴下80滴左右，每小时回流6-12次为宜，提取过程应注意防火。    ⑤在抽提时，冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样，可防止空气中水分进入，也可避免乙醚挥发在空气中，如无此装置可塞一团干燥的脱脂棉球。    ⑥抽提是否完全，可凭经验，也可用滤纸或毛玻璃检查，由抽提管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上，挥发后不留下油迹表明已抽提完全。    ⑦在挥发乙醚或石油醚时，切忌用直接火加热，应该用电热套，电水浴等。烘前应驱除全部残余的乙醚，因乙醚稍有残留，放入烘箱时，有发生爆炸的危险。    ⑧反复加热会因脂类氧化而增重。重量增加时，以增重前的重量作为恒重。    ⑨因为乙醚是麻醉剂，要注意室内通风。2.2  聚同电子酸分解法     某些食品中，脂肪被包含在食品组织内部，或与食品成分结合而成结合态脂类，如，谷物等淀粉颗粒中的脂类，面条、焙烤食品等组织中包含的脂类，用索氏提取法不能完全提取出来。这种情况下，必须要用强酸将淀粉、蛋白质、纤维素水解，使脂类游离出来，再用有机溶剂提取。    此法使用于各类食品总脂肪的测定，特别对于易吸潮，结块，难以干燥的食品应用本法测定效果较好，但此法不宜用高糖类食品，因糖类食品遇强酸易炭化而影响测定效果。    应用此法，脂类中的磷脂，在水解条件下将几乎完全分解为脂肪酸及碱，当用于测定含大量磷脂的食品时，测定值将偏低。故对于含较多磷脂的蛋及其制品，鱼类及其制品，不适宜用此法。    (一）原理    将试祥与盐酸溶液一同加热进行水解，使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来，再用乙醚和石油醚提取脂肪，回收溶剂，干燥后称量，提取物的重量即为脂肪含量。（二） 适用范围与特点    此法适用于各类、各种状态的食品中脂肪测定。特别是加工后的混合食品，易吸湿，不好烘干的，用索氏提取法不行的样品，效果更好。    本法不适于测定含磷脂高的食品、如：鱼、贝、蛋品等。因为在盐酸加热时，磷脂几乎完全分解为脂肪酸和碱，当只测定前者时，使测定值偏低。本法也不适于测定含糖高的食品，因糖类遇强酸易炭化而影响测定。    (1) JTONE仪器    ① 恒温水浴50~80℃    ② 100ml 具塞量筒    (2) 试剂    ① 乙醇（95%体积分数）    ② 乙醚（不含过氧化物）    ③ 石油醚（30~600C沸腾）    ④ 盐酸    (3) 聚同电子测定步骤①  水解：准确称取固体样品2g于50ml大试管中，加入8mL水，用玻璃棒充分混合，加10ml盐酸。或称取液体样品10g于50mL大试管中，加10mL盐酸。混匀后于70~80℃的水浴中，每隔5~10min用玻璃棒搅拌一次至脂肪游离为止，约须40~50min，取出静置，冷却。②  提取：取出试管加入10mL乙醇，混合。冷却后将混合物移入100mL具塞筒中，用25mL乙醚分次冲洗试管，洗液一并倒入具塞量筒内。加塞振摇1min，将塞子慢慢转动放出气体，再塞好，静置15min，小心开塞，用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置10~20min,待上部液体清晰，吸出上层清夜于已恒量的锥形瓶内，再加入5ml乙醚于具塞量筒内振摇，静置后仍将上层乙醚吸出，放入原锥形瓶内。将锥形瓶于水浴上蒸干，置95~105℃烘箱中干燥2h，取出放干燥器中冷却30min后称量    (4) 结果计算 (5) 说明    ①开始加入8mL水是为防止后面加盐酸时干试样固化，水解后加入乙醇可使蛋白质沉淀，降低表面张力，促进脂肪球聚合，同时溶解一些碳水化合物如糖，有机酸等。后面用乙醚提取脂肪时因乙醇可溶于乙醚故需加入石油醚降低乙醇在醚中的溶解度，使乙醇溶解物残留在水层，使分层清晰。     ②挥干溶剂后残留物中若有黑色焦油状杂质，是分解物与水一同混入所致，会使测定值增大造成误差，可用等量的乙醚及石油醚溶解后，过滤，再次进行挥干溶剂的操作。③若无分解液等杂质混入，通常干燥2h即可恒量。2.3 氯仿-甲醇提取法    索氏提取法对包含在组织內部的脂肪等不能完全提取出来，酸分解法常使磷脂分接而损失。而在一定的水分存在下，极性的甲醇及非极性的氯仿混合溶液却能有效地提取结合态脂类，如脂蛋白、蛋白脂等及磷脂，此法对于高水分生物试样如鲜鱼、蛋类等脂类的测定更为有效。 (1)原理    氯仿-甲醇提取法的原理是将试样分散于氯仿-甲醇混合液中，于水浴上轻微沸腾，氯仿-甲醇混合液与一定的水分形成提取脂类的有效溶剂，在使试样组织中结合态脂类游离出来的同时与磷脂等极性脂类的亲合性增大，从而有效地提取出全部脂类。再经过滤，除去非脂成分，然后回收溶剂，对于残留脂类要用石油醚提取，定量。(2)  仪器①具塞三角瓶    ②电热恒温水浴：50~100℃    ③提取装置   ④布氏漏斗   ⑤具塞离心管   ⑥离心机：3000r/min（3）试剂    ①氯仿：97%（体积分数）以上。    ②甲醇：96%（体积分数）以上。     ③ 氯仿甲醇混合液：按2：1体积比混合。    ④ 石油醚。    ⑤ 无水硫酸钠：以120~135℃干燥1~2h。  （4）操作步骤　  ①提取      准确称取均匀样品5g于具塞三角瓶内（高水分食品可加适量硅藻土使其分散），加入60mL氯仿-甲醇混合液（对于干燥食品，可加入2~3mL水）。连接提取装置，于650C水浴中，由轻微沸腾开始，加热1h进行提取。 　  ②回收溶剂    提取结束后，取下烧瓶用布氏漏斗过滤，并用氯仿-甲醇混合液洗涤滤器，烧瓶及滤器中试样残渣，滤液、洗涤液一并收集于具塞三角瓶内，置65~700C水浴中回收溶剂，至烧瓶内物料呈浓稠态，而不能使其干，然后冷却。    ③石油醚萃取、定量    用移液管加入25ml石油醚，然后加入15g无水硫酸钠，立即加塞混摇1 min ，将醚层移入具塞离心沉淀管进行离心分离（3000r/min）5min.用10mL移液管加入迅速吸取离心管中澄清的石油醚10mL,于已称量至恒量的干燥称量瓶内，蒸发去除石油醚，于100~105℃烘箱中烘至恒量（约30 min ）。（5）结果计算2.4罗斯•哥特里法    此法为国际标准化组织（ISO），联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）等采用，为乳、炼乳、奶粉、奶油等脂类定量的国际标准法。它适用于各种液状乳（生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等）、各种炼乳、奶粉、奶油 及冰淇淋。除乳制品外，也适用于豆乳或加工成乳状的食品。（一）原理    利用氨-乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜使非脂成分溶解于氨-乙醇溶液中，而脂肪游离出来，再用乙醚-石油醚提取出脂肪，蒸馏去除溶剂后，残留物即为乳脂肪。   （二）适用范围与特点    本法适用于各种液状乳(生乳、加工乳、部分脱脂乳、脱脂乳等)，各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。（三）测定方法     取一定量样品于抽脂 瓶中，分别加入氨水，乙醇，乙醚，石油醚，充分摇匀，待上层液澄清时。读取醚层体积，放出一定体积醚层于一已值重的烧瓶中，蒸馏回收乙醚和石油醚，烘干至恒重，称重。2.5 巴布科克法和盖勃法（一）原理    用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白，使脂肪球膜被破坏，脂肪游离出来，再利用加热离心，使脂肪完全迅速分离，直接读取脂肪层的数值，便可知被测乳的含脂率。（二）适应范围与特点        这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法，适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。对含糖多的乳品(如甜炼乳、加糖乳粉等)，采用此方法时糖易焦化，使结果误差较大，故不适宜。    此法操作简便，迅速。对大多数样品来说测定精度可满足要求，但不如重量法准确。 (三)测定方法精密吸取17.6mL样品，倒入巴布科克氏乳脂瓶中，再取17.5mL硫酸，沿瓶颈缓缓注入瓶中，将瓶颈回旋，使液体充分混合，至无凝块并呈均匀棕色。置乳脂离心机上，以约1000r/min的速度离心5min，取出，加入80ºC以上的水至瓶颈基部，再置离心机中离心2min，取出后再加入80ºC以上的水至脂肪浮到2或3刻度处，再置离心机中离心1min，取出后置55~60ºC水溶中，5min后立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数，即为样品含脂肪的百分数。 (四) 说明及讨论① 硫酸的浓度要严格遵守规定的要求，如过浓会使乳炭化呈黑色溶液而影响读数；过稀则不能使酪蛋白完全溶解，会使测定值偏低或使脂肪层混浊。     ② 硫酸除可破坏脂肪球膜，使脂肪游离出来外，还可增加液体相对密度，使脂肪容易浮出。     ③ 盖勃法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出，并能降低脂肪球的表面张力，以利于形成连续的脂肪层。     ④ 加热（65~70ºC水浴）和离心的目的是促使脂肪离析。。    ⑤ 巴布科克法中采用17.6ml标准吸管取样，实际上注入巴氏瓶中的样品只有17.5ml，牛乳的相对密度为1.03，故样品重量为17.5×1.03=18g。巴氏瓶颈的刻度（0~10%）共10个大格，每大格容积为0.2ml，在60ºC左右，脂肪的平均相对密度为0.9，故当整个刻度部分充满脂肪时，其脂肪重量为0.2×10×0.9=1.8g。18g样品中含有1.8g脂肪，即瓶颈全部刻度表示为脂肪含量10%，每一大格代表1%的脂肪。故瓶颈刻度读数即为样品中脂肪百分含量。     ⑥每组样品只取两格乳脂瓶进行测定。放入离心机时，必须对称放置。     ⑦硫酸的浓度和用量必须严格按照规定，沿瓶壁缓慢加入，回旋摇动，使充分混合 ，否则易时脂肪层产生黑色块粒。补充： 食用油脂几项理化特性的测定    一、酸价的测定酸价——中和 1 g 油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量(mg)。酸价是反映油脂酸败的主要指标。    二、碘价的测定碘价（碘值）——100 g 油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算成碘的质量(g)。碘价在一定范围内反映油脂的不饱和程度。    三、过氧化值的测定过氧化值——滴定 1g 油脂所需用( 0.002 mol/L ) Na2S2O3 标准溶液的体积(mL)。过氧化值的大小是反映油脂是否新鲜及酸败的程度。    四、皂化价的测定皂化价——中和 1 g 油脂中的全部脂肪酸（游离+结合的）所需氢氧化钾的质量(mg)。皂化价可对油脂的种类和纯度进行鉴定。    五、羰基价的测定    用羰基价来评价油脂中氧化物的含量和酸败程度。    总羰基价—— 用比色法测定。思考题1、脂类测定提取剂的种类、优缺点。2、索氏提取法的原理、方法、注意事项。3、乳脂肪的测定方法有哪几种？4、食用油特性（酸价、碘价、氧化值、过氧化值、皂化价、羰基价）的定义。  参考资料：杭州聚同电子有限公司