天然产物中超临界流体色谱检测方案(超临界色谱)

智能文字提取功能测试中

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2016，36(8)·1317· 综述专论 超临界流体色谱在天然产物分离分析中的应用进展* 朱玲玲，赵阳，孙欣光，刘大伟²，张大兵²，刘超1，马百平1** (1.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850；2.江苏汉邦科技有限公司，淮安223005) 摘要：超临界流体色谱(SFC)是一种高效的色谱技术，是液相色谱和气相色谱的重要补充，在天然产物的分析和分离制备方面均有应用。SFC 既能够分离分析不适宜于气相色谱的弱极性物质，如脂肪酸、酰基甘油等，又能够用于生物碱、黄酮等极性天然产物的分析。SFC 分离天然产物有分离性能好，效率高，回收率好，有机试剂使用量少等优点。本文主要检索了2009—2016年的 PubMed、ScienceDirect、中国知网等数据库，查阅国内外文献46篇，其中国内文献13篇，国外文献33篇，总结了超临界流体色谱在天然产物分析、分离制备中的应用进展。 关键词：超临界流体色谱； SFC；天然产物分析；天然产物制备；应用进展 中图分类类：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2016)08-1317-07 doi：10.16155/j.0254-1793.2016.08.01 cne ue Application of supercritical fluid chromatography in natural products ZHU Ling-ling，ZHAO Yang，SUN Xin-guang，LIU Da-wei ，ZHANG Da-bing， LIU Chao， MA Bai-ping1** (1. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China； 2. Jiangsu Hanbon Science & Technology Co.， Ltd， Huai an 223005， China) Abstract： Supercritical fluid chromatography (SFC )is an efficient separation technique， which is also animportant supplement to high performance liquid chromatography (HPLC)and gas chromatography(GC). SFChas been utilized for the analysis and separation of natural products. SFC is adopted for the analysis of non-polarnatural products which are not conveniently separated by GC， such as fatty acids， acylglycerols and so on. With theextension of mobile phase and development of more columns，SFC can be used for the analysis of some polar naturalproducts，such as alkaloids and flavones. SFC has the advantages of good resolution， high efficiency， good recoveryand low consumption of organic solvents in separation of natural products. This review provides a summary of theapplications of SFC in analysis and separation of natural products according to thirteen articles in Chinese ( * 国家自然科学基金面上项目(81373938)；国家科技重大专项“重大仪器专项”(2013YQ170525)；北京市自然科学基金面上项目(7152114) ** 通信作者 Tel：(010)66930265；E-mail： mabaiping@sina.com ) ( 第一作者 Tel：(010)66932247；E-mail： zhulingling0123@126.com ) and thirty-three articles in English mainly published in PubMed，ScienceDirect and CNKI databases from 2009 to 2016.Keywords： supercritical fluid chromatography； SFC； natural product analysis； natural product preparation；application progress 超临界流体色谱(supercritical fluid chromatogra-phy，简称 SFC )是指以超临界流体为流动相，以固体吸附剂(如硅胶)或键合到载体(如毛细管壁)上的高聚物为固定相的色谱。1962年 Klesper首次应用超临界流体(二氯二氟甲烷和一氯二氟甲烷)成功分离了金属卟啉化合物。目前， SFC 一般使用超临界二氧化碳(CO，)流体作为流动相。超临界 CO，的高扩散性和低粘性使 SFC 兼备了 GC 和 LC的特点，SFC既可以分析 GC 不适宜的高沸点、低挥发性、热不稳定的弱极性化合物，又因其具有较好的分离性能，能用于 HPLC难以分离的极性样品。由于超临界CO，的特性， SFC 可涵盖现有的正相、反相的各类色谱柱；同时，随着色谱柱技术的发展，适用于 SFC 的各种填料种类、粒径、规格的手性和非手性色谱柱越来越多，如 Kalikova等综述了2001年至2013年之间应用于 SFC 的各种手性色谱柱。SFC 可以联用的检测器包括 GC 型和 HPLC 型检测器。 GC 型检测器包括热离子检测器、火焰光度检测器等； HPLC 型检测器包括紫外检测器、蒸发光散射检测器等。SFC还可以与MS、NMR等技术联用，与 HPLC 和NMR联用技术相比，作为流动相的 CO， 没有氢信号，因而不需要考虑水峰抑制问题3。近几年来， SFC 仪器得到了很大的发展，国外仪器公司推出了超高效合相色谱仪和混合型色谱仪 SFC-UHPLC 等仪器，国内公司也致力于超临界色谱仪的研制，包括分析型、制备型及模拟移动床 SFC 等。色谱柱和 SFC 设备的发展使得 SFC 的应用越来越广泛，手性化合物的拆分是SFC 最重要的应用领域。国内外均有不少 SFC 用于手性化合物分离分析的研究报道，吴夏青[4]Plotka等15.也综述了 SFC 在手性化合物方面的研究及应用进展。除此之外， SFC 在非手性化合物的分离分析上也有很大发展。根据固定相和流动相组成的不同特点， SFC 可以分为反相 SFC、正相SFC、离子对 SFC 和HILIC-SFC 4种不同类型，分离不同性质的非手性化合物，如高分子材料、磷脂16-81等。近几年 SFC 在天然产物方面的应用研究也逐渐增多，不仅用来分离脂肪酸、挥发油等弱极性天然产物，也应用于生物碱、黄 酮、皂苷等极性天然产物的分离。本文主要对2009年至2016年SFC 在天然产物分析和分离制备方面的应用进井了总结，以期更好地推动 SFC 在难分离复杂天然产物中的应用，弥补 GC 和 HPLC 的不足。 SFC 在天然产物分析中的应用 1.1 维生素类维生素和类胡萝卜素广泛存在于自然界中，虽然其在人体内的含量很少，但是在人体生长、代谢、发育的过程中发挥着重要作用。维生素可以分为水溶性维生素(包括维生素C和维生素B族)及脂溶性维生素(包括维生素A、D、E、K等)。类胡萝卜素含有一系列共轭双键，为脂溶性化合物，具有很好的抗氧化活性及其他作用，如番茄红素、叶黄素、玉米黄素等。 NL水溶性维生素常用的测定方法主要包括比色法、分光光度法、分子荧光法和HPLC法等。分光光度法和分子荧光法的样品处理过程复杂； HPLC法有离子对色谱、胶束色谱和非离子对色谱等，离子对色谱中离子对试剂对色谱柱及泵的损害较大110-111。而SFC 测定水溶性维生素，前处理简单，分析时间短，分离效果好。竹弘等112建立了SFC-UV同时分离测定维生素B、维生素B、维生素B和烟酰胺含量的方法。维生素B维生素B，、维生素B，和烟酰胺的极性较大，在氰基柱 Kromasil 60-5CN 柱上有较好的保留。以超临界 CO-甲醇(含0.1%二乙胺)组成的流动相进行梯度洗脱， SFC 能在11 min 内完成复合维生素片中4种维生素的含量测定；刘倩倩等13.建立了采用超高效合相色谱(UPC)CSH Fluoro-Phenyl 色谱柱，含0.05%磷酸的甲醇为改性剂，背压1.4×10'Pa，温度30℃，梯度洗脱的条件下测定维生素C含量的方法，并且在7 min 内对橘子、饮料、鲜枣及干枣样品中维生素C含量进行了测定。 SFC不仅能够快速有效地测定水溶性维生素的含量，而且在脂溶性维生素的分析中也具有明显优势。Mejean 等14建立了以Amine Luna NH， 色谱柱为分析柱，乙醇(0.1%甲酸)为改性剂，柱温30℃的色谱条件，首次使用 SFC/APPI MS 分离检测大豆油中生育酚类和生育三烯酸类化合物，并以峰面积进行定 量的分析方法。 SFC 不仅能单独分析水溶性维生素或者脂溶性维生素，而且还能同时分析水溶性和脂溶性维生素。Taguchi 等115成功地利用 SFC，采用 ACQUITY UPCHSS Cig SB (50 mm×3.0 mm，1.8um)色谱柱，含0.2%甲酸铵盐的甲醇-水(95：5，v/v)为改性剂，柱温为40℃的条件梯度洗脱，在4 min 内同时分离检测了8种水溶性和9种脂溶性维生素。 SFC 分离水溶性维生素时一般选用填料极性较大的色谱柱，洗脱能力较强的甲醇作改性剂；而 SFC分离脂溶性维生素时选用填料极性较小的色谱柱，洗脱能力相对弱的乙醇和乙腈为改性剂。采用SFC分析水溶性或者脂溶性维生素，可以根据化合物的酸碱性，在改性剂中加人适当的酸性或碱性添加剂来改善峰形。更值得关注的是， Taguchi 等115在一定的条件下实现了超临界色谱和液相色谱的统一。在随流动相中改性剂比例变化的背压、较高的的柱和合适的 UPCHSS CIg SB 色谱柱(既有硅醇基又有十八烷基链)的条件下，首次成功实现了以超临界态流动相开始，改性剂比例梯度增加变成亚临界态流动相，直至改性剂的比例达到100%成为液态流动相的梯度洗脱过程。 手性异构体的分离也是维生素样品分析的重要内容，因为维生素的手性不同，其活性也不同。Khater等116利用SFC-MS在采用 Chiralpak IA 手性色谱柱， CO-甲醇(89：11，ulv)为流动相，柱温25℃，背压1.5×10Pa，流速2.3mL·min的条件下有效分离了化妆品中维生素原B，的手性异构体，并以N- 乙酰基-L-丙氨酸为内标，测定化妆品中有效的D-(R)-泛醇的含量及纯度。 SFC 除了能够分析药品、食品或化妆品样品中的维生素外，也能分析血液等生物样品中的维生素类化合物。Matsubara 等171建立了使用 ODS 色谱柱同时检测类胡萝卜素及其环氧化产物的 SFC-MS/MS 方法。该方法灵敏度高，仅使用0.1mL 的血清样品和2.5 mg的低密度脂蛋白就能检测出其中微量的5种类胡萝卜素和6种环氧化产物，而且分析时间仅需 20 min，远少于HPLC 法的 85 min 及 UPLC 法所需的 46 min。 1.2 脂肪酸和甘油酯类脂肪酸和甘油酯均拥有较长的烃链，不溶于水，都是弱极性成分。常用 GC 法分析脂肪酸，但 GC 法样品需要衍生化，前处理过程复杂。而 SFC 分析脂肪酸时无需进行衍生化处理，方法简单。林春花等建立了 UPC -MS方法快速分 析棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸5种常见脂肪酸的方法，并且成功应用于玉米油、葵花籽油、橄榄油、茶油、大豆油和花生油中常见脂肪酸!18.以及工业油酸中5种脂肪酸的含量测定[19]；文中采用 ACQUITY UPC BEH 2-EP色谱柱，以甲醇-乙腈(1：1，v/v)为改性剂，梯度洗脱，在电喷雾负离子模式下进行检测，外标法定量，在3 min 内完成了各样品中脂肪酸的含量测定。 已有的分析甘油酯的方法有 HPLC 法和银离子色谱法。HPLC法使用非水的流动相进行洗脱，分析时间长，等度洗脱时间需近 300 min，梯度洗脱时间仍需 140 minl 20-21J；银离子色谱法分析甘油酯时所需的柱平衡时间长，峰形差，重现性差22。。甘油酯类化合物的同分异构体较多，尤其是双键位置异构的甘油酯异构体分离难度大。而利用 SFC 分析甘油酯时分析时间短，分离效果好，异构体也能得到有效的分离。Lesellier 等23采用4根 Kinetex Ci8(150mmx4.6 mm，2.6um)柱串联 15cm 的 Accucore Cis色谱柱，乙乙-甲醇(90：10，u/u)为改性剂，在60min 内分析了坚果油和油菜籽油样品并很好地分离样品中的酰基甘油对映体。Lee等24利用 SFC-MS采用 C3o色谱柱YMC carotenoid柱，含0.1%甲酸铵盐的甲醇为改性剂进行梯度洗脱，较好地分离了食用油样品中的甘油酯同分异构体。Ashraf-Khorassani等125】利用SFC-MS 以 ACQUITY UPC HSS Cig SB(150mm×3.0 mm，1.8um)柱为分析柱，乙腈为改性剂，2%~20%乙腈的洗脱梯度，快速分析了大豆豆、玉米油、芝麻油及西红柿籽油样品中的三酰基甘油成分，并能检测样品中的微量杂质，为纯化工艺的优化提供依据。虽然 Lesellier、Lee 和 Ashraf-Khorassani采用 SFC 分析甘油酯时所用的色谱柱柱长、粒径和种类均不相同，但是选择的色谱柱都是长链烷基键合固定相，有较高的碳含量和较好的疏水性。除色谱柱外，流动相中改性剂的种类和比例对甘油酯的保留和分离也有较大的影响。因此，色谱柱的选择和流动相的优化都是 SFC 能够较好地分析甘油酯的关键。 SFC 不仅可以单独分析脂肪酸和甘油酯类成分，还能和HPLC串联成二维色谱完成对复杂样品的分析。Francois等1261采用在线 SFC×HPLC二维色谱成功地分析了鱼油样品中的脂肪酸类成分，并与HPLC×HPLC 色谱进行了对比。HPLC×HPLC 色谱的峰容量(90)明显小于 SFC×HPLC 色谱的峰容量 (550)。由此可见， SFCxHPLC 二维色谱的正交性更强，互补性更好，优势更加明显。Francois等127还采用了离线 SFC×HPLC二维色谱分析了鱼油样品中复杂的甘油酯类成分，并且有效地分离了甘油酯同分异构体。Gao 等128利用 NPLC × SFC 二维色谱分析了灵芝子实体中低极性化合物(如脂肪酸等)。 1.3 生物碱类 SFC在分析生物碱方面的应用较少，但也有文献报道了利用 SFC 分析吴茱萸中吲哚类生物碱129-30及雷公藤中大环内酯倍半萜类生物碱31。杨敏等129J利用 Thar 超临界流体色谱仪，采用 Kromasil Slica 色谱柱，CO-甲醇(87：13，vlv)为流动相，柱温60℃，背压2.0×10'Pa，流速2.0mL·min，在6 min 内基线分离了吴茱萸碱和吴茱萸次碱，并测定了吴茱萸药材中二者的含量。李振宇等130」采用ACQUITY UPC色谱仪， 以 ACQUITYUPC'BEH柱为分析柱，甲醇为改性剂，柱温35℃和背压2.07×10Pa 的条件，15 min 内完成复杂吴茱萸样品的快速分析。Fu等131利用 SFC-DAD-MS，采用ACQUITY UPC' BEH 2-EP 色谱柱，甲醇为改性剂，柱温45℃，背压1.38×10Pa，流速1.0 mL· min的条件下梯度洗脱，10 min 内完全分离了6种倍半萜类生物碱对照品，并且对雷公藤样品进行分析，鉴定出了72个不同的大环内酯倍半半类生物碱，包括40个 wilfordate/evoninate 型， 13个 iso-型和19个 hydr-oxyl-型生物碱。虽然杨敏、李振宇等分析生物碱使用的色谱柱不同，但是色谱柱填料为硅胶或表面键合极性基团的硅胶，是极性较大的色谱柱。此外，由于色谱峰拖尾现象不严重， SFC分析生物碱时可以使用纯甲醇作为改性剂。 1.4 黄酮类SFC 在分析黄酮类天然产物的应用也较少。2013年 West 等32在 SFC 的流动相组成对非手性色谱柱选择性和保留的影响的研究中，以黄酮对照品作为样品之一进行分析，验证了使用非手性固定相时不同种类的非手性色谱柱对分离的影响较大，同一非手性色谱柱不同的流动相组成对分离影响较小的观点。而在2015年初 Ganzera 33」采用 SFC 以ACQUITY UPCBEH 为分析柱，含0.05%磷酸的甲醇为改性剂，分离9种不同异黄酮并且测定大豆、红豆、野葛样品中所含异黄酮含量的报道进一步验证了上述观点。Ganzera 考察了色谱柱种类、柱温及改性剂对异黄酮分离的影响，色谱柱对分离的影响最大，不同改性剂及柱温对分离的影响小。 1.5 苯丙素类 苯丙素类化合物包括简单苯丙素类、香豆素类、木脂素类。一些弱极性苯丙素类化合物，如挥发油中的香豆素类成分，使用反相HPLC分析时，色谱柱上保留较强，分离较困难。Desmortreux等[34利用SFC采用Discovery HS F5色谱柱，乙醇为改性剂，柱温35℃、背压1.0×10Pa、流速3mL·min的条件下进行梯度洗脱，11 min 内分离了16种香豆素类成分，并且分析了柠檬皮渣的香精油样品，检测出包括对照品在内的25个香豆素类成分。色谱条件优化中色谱柱对分离的影响最大，不仅色谱柱的种类对分离有影响，而且同一种类不同厂家的色谱柱分离效果也有很大不同。Desmortreux等考察了3个不同厂家的五氟苯基柱，其中 DiscoveryHS F5 柱的柱效最好。SFC 不仅能定性分析，还能定量测定苯丙素类化合物。邓亮等351建立了 SFC 同时测定厚朴中厚朴酚及和厚朴酚含量的方法。采用Kromasil 色谱柱，流速3mL·min、背压2.0×10Pa、柱温50℃，CO-甲醇(95：5， u/v)等度洗脱的条件下 20 min 内完全分离了厚朴酚及和厚朴酚同分异构体，并测定了厚朴药材中二者的含量。 1.6 萜类化合物SFC在萜类化合物分析中的应用也有不少文献报道。三萜类化合物是萜类中重要的一类成分。三萜类化合物的常用分离分析方法有 TLC、GC、HPLC 等， GC 分析时需衍生化处理，HPLC分离三萜类化合物难度较大。而 SFC 分离三萜类化合物无需衍生化，分离效果好，具有明显优势。Lesellier等1361利用 SFC 在以 Synergi Polar-RP柱为分析柱，背压1.2×10'Pa，柱温20℃，流速3mL·min，流动相CO-甲醇(97：3，p/D)的条件下，20 min 内分离了8种三萜对照品，并分析了4种苹果渣提取物，鉴定了包括3个对照品在内的11个三萜类化合物。Samimi 等137采用了超临界流体萃取(SFE)技术提取西洋参，同时利用 SFC-ELSD 在采用极性氰丙基柱，含0.05%三氟乙酸的甲醇为改性剂，压力1.5×10'Pa，温度50.0℃，流速1.5 mL·min的条件下分析了人参皂苷混合对照品和 SFE 提取部分，确定了 SFE 提取部分中各人参皂苷的含量分布。 此外， SFC 在分离萜类手性异构体具有明显优势，能够明显改善分离度，提高分离效率。 Schaffrath等138使用包含直链淀粉型手性柱、纤维素型手性柱和 Pirkle 型的16种不同手性色谱柱分离了7组螺环萜手性异构体，比较了 HPLC 和 SFC 分离手性化合 物的能力。HPLC使用IA、IF、AD、AS、IC、OD、OJ柱对部分手性异构体有较好的分离，而 SFC 使用大部分手性色谱柱都能分离1组或几组手性异构体。因此， SFC 分离螺环萜手性异构体具有明显优势。 Qiao 等139利用SFC在采用Chiralcel OJ-H手性色谱柱，甲醇为改性剂，流速2.0 mL·min，柱温40℃，压力1.2×10'Pa 的条件下分离了樟芝中7对25R/S异构的麦角甾烯型三萜化合物，尤其是 HPLC上很难分开的(25S)-antcin A 和(25R)-antcin A 在4 min 内基线分离，(25S)-antcin B 和(25R)-antcinB也在 6 min 内得到分离。 1.7 其他天然产物SFC 也能够代替正相 LC法和需衍生化样品的 GC 法分析氨基酸手性对映体。Bernal等140首次选用了 Chirobiotic T2柱(硅胶表面键合 teicoplanin )，以改性剂甲醇-水(90：10，u/u)为35%或40%比例的流动相成功分离了3对芳香氨基酸手性异构体，并且测定了食品添加剂中芳香氨基酸的含量。由于氨基酸极性较大， SFC分析氨基酸时需要选择极性较大的色谱柱和流动相。 SFC在海洋生物的分析中也有具有一定的优势。Frenkel等41j采用 SFC 首次成功分析了海洋硅藻中GC和 HPLC 均未能分离的哌嗪二酮类信息素对映体。以直链淀粉-一(3，5-二甲基苯基甲酸酯)为手性固定相， CO-异丙醇为流动相，在4 min 内分离了对映体；同时采用 SFC 串联 ESI质谱直接分析海水中经过 SPE 富集的环状二肽，检测释放的信息素对映体并跟踪检测信息素在硅藻内部的降解产物。 2 SFC 在天然产物分离制备中的应用 SFC 是一绿绿色环保的快速分离技术，能方便地将分析方法放大到半制备/制备的纯化方法，从而能低成本、高效率地获得高纯度的单一化合物，大大提高工作效率。Catchpole等142利用半制备 SFC分离制备了海藻油和鱼油中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中得到的EPA 纯度均大于95%，DHA 纯度大于80%。分离 EPA 的最佳条件如下：色谱柱采用 GreenSepM Silica (5pm)柱，流动相为纯超临界 CO，，压力为1.7×10Pa，温度为333K，进样体积为364 pL，海藻油制备流速为 7.5 mL·min[花生四烯酸(AA)和EPA 能完全分离]，鱼油制备流速为10 mL·min。而分离鱼油中 DHA 所用的色谱柱为 GreenSepTM PFP柱，流速为15 mL·min。 SFC不仅适用于分离制备弱极性化合物，如脂 肪酸，也能够制备极性化合物，如柠檬酸等。吕惠生等1431建立了 SFC 直接从柠檬酸发酵液中分离制备柠檬酸的方法。在采用5 pm 的 ZORBAX SB-CN色谱柱，甲醇为改性剂，流速15g'min，柱温313.15K，柱压1.3×10'Pa，上载量0.05 mL的条件下对柠檬酸发酵液中的柠檬酸和乌头酸进行分离制备，得到纯度为99.6%的柠檬酸。Garcia-Risco等采用 SFE 和 SFC 分离制备了百里香叶中的麝香草酚144和迷迭香叶中的鼠尾草酸 45。 Garcia-Risco等1441采用Kromasil 60-5SIL 填充色谱柱，柱温323K，背压1.5×10'Pa，流动相CO，-乙醇(97：3，vlv)的条件从SFE 提取部分中制备得到麝香草酚，回收率高达97.2%。而 Garcia-Risco 等45]在制备鼠尾草酸时除压力、温度、改性剂含量等，还着重考察了4种不同色谱柱对分离的影响， Viridis SFC 2-ethylpyridine柱对鼠尾草酸和鼠尾草酚的分离度好，且纯度大于92%，回收率大于97% 在分离制备天然产物手性异构体方面， SFC 同样具有比 HPLC 更好的分离效能。Qiao 等139不仅利用SFC分析了牛樟芝中7对25R/S-异构的三萜类化合物，而且采用制备型 SFC 利用 Chiralcel OJ-H手性柱分离制备了 HPLC 上很难分离的手性对映异构体，得到了手性对映体的单一成分。Zhao等146采用SFC 技术对胡芦巴中 HPLC 难以分离的6对螺甾皂苷25R/S异构体混合物进行有效分离分析，并且采用串联后400 mm 长的 CHIRALPAK IC手性色谱柱，甲醇为改性剂，对3对25R/S异构体进行分离制备，得到了纯度大于99%的单一螺甾皂苷。 从上述制备过程中可以看出，无论是弱极性成分还是极性化合物，选择合适的色谱柱是分离制备单体化合物的关键。由于超临界 CO，的低粘度和高扩散性等特点，减少了对色谱柱种类、柱长、粒径的限制，扩大了 SFC 所能选择色谱柱的范围，降低了各类天然产物分离制备的难度。SFC 分离制备天然产物具有比 HPLC 更好的分离性能，更简单的样品后处理方法，更加绿色安全等优点。 3 结论 近年来 SFC 得到了迅速发展，商品化的 SFC 分析和制备仪器在不断地进步发展。SFC 能够分析弱极性天然产物，尤其是不适宜于 GC 分离的非挥发性物质。随着手性和非手性色谱柱技术的发展，以及包含固定相、流动相、背压等优化的色谱方法的开发， SFC 也开始应用于分离极性天然产物，如生物碱、黄酮、皂苷等。SFC 分离天然产物具有很好的分离性能，广泛的色谱柱选择范围等优点，能够解决一些其他色谱技术无法解决天然产物分离的难题。但是，目前对SFC 分离分析天然产物的了解有限， SFC 的应用主要仍集中在少数弱极性天然产物和手性异构体方面，对极性天然产物的分析和制备的应用仍然较少。随着技术的发展以及人们对其持续的关注，需要进一步加快SFC分离各类天然产物的色谱方法的开发，加强SFC 对各类天然产物分离的规律和特点的深入研究，推动 SFC 在天然产物的分析和制备中的应用。 ( 参考文献 ) ( [ 1 ] KLESPER E. High pressure gas chromatography above criticaltemperatures[J ]. J Org Chem， 1962，27(2)：700 ) ( [21 KALIKOVA K，SLECHTOVA T， VOZKA J， et al. Supe r critical fluid chromatography as a tool for e n antioselective separation： A re v iew [J]. Anal Chim Acta， 2014，821：1 ) ( [3] 陈志伟，陈忠.超临界流体分离与 NMR联用技术极其应用[J ]. 光谱实验室，2001，18(2)：139 CHEN ZW， CHEN Z. Hyphenation of supercritical f l uid s eparationwith nuclear magnetic r esonance and their applications [J]. C hin JSpectrose Lab， 2001 ， 18(2)：139 ) ( [4 ] 吴夏青，齐建平，王欣然，等.超临界流体色谱分离手性药物研究进展[J].分析仪器，2014(3)： 1 WU X Q ， OI JP， W ANG XR， et al. Rec e nt advances in chi r al dr u gseparation by supercritica l fluid chromatography[J ]. Anal Instrum，2014(3)：1 ) ( [5] P LOTKA JM， BIZIUK M， MORRISON C，et al. Pharmaceutical an d f orensic drug a p plications of chiral supercritical fl u id chromatography[J]. Trends Anal Chem， 2014， 56：74 ) ( [6] WEST C， OGDEN J，LESELLIER E. Possibility of predicting separations in supereritical fluid c hromatography with the sol v ationparameter model [J ]. J Chromatogr A，2009，1216(29)：5600 ) ( [ 7] UCHIKATA T，MATSUBARA A，FUKUSAKI E， et al.High- throughput phospholipid proflling system based on supercritical f l uidextraction-supercritical fluid chromatography/mass spectrometry fordried plasma spot analysis [J ] . J Chromatogr A， 2012 ， 1250：69 ) ( [ 8] EBINGERA K，N.WELLER H. Comparative assessment of achiral stationary phases f or high t hroughput analysis in supercritical f luidchromatography[J]. J Chromatogr A， 2014， 1332：73 ) ( [ 9] 常相娜，黄荣清，王正平，等.B族维生素测定方法研究进展[J]. 科学技术与工程，2004，4(4)：312 CHANG XN， HUANG RQ， WANG ZP， et al. Research progress in determination methods of B vitamins [ J ]. Sci Technol Eng，2004，4(4)：312 ) ( [10] 邓光辉，李济权，马少妹.高效毛细血管电泳电导法快速检测复方维生素B片中的VB、VB2、VB。和VC[J]分析实验室， 2003，22(4)：53 ) ( DENG GH， LI JQ ， MA SM. Saparation and determination of V B ，VB2，VB。 and VC in compound vitamin B tablet by high performancecapillary electrophoresis conductivity detection [J]. C h in J An a lLab，2003，22(4)：53 ) ( [1 1 ] 顾丽娟，杨大龙，冷柏榕，等.离子对 HPLC 法测定五维牛磺酸口服液中4种水溶性维生素[J].药学与临床研究，2011，19(4)：381 GU LJ， YANG DL， LENG BR，e t al. Dete r mination of four vitaminsin five vitamins and taurin e oral solution by IP-HPL C [J ] . PharmClin Res， 2011， 19(4)：381 ) ( [12] 竹弘，梁初燕，陈新雷.超临界流体色谱同时测定4种水溶性维 生素[J].广东化工，2013，40(12)：187 ZHU H， LIANG CY， C H EN XL. Determination of four water solublevitanmins b y s upercritical fluid chromatography [J]. Guangdong Chem Ind， 2013，40( 1 2)：187 ) ( [13]文 刘倩倩，周围，王波，等.超高效合相色谱法直接检测维生素C的 方法研究[J].食品科学，2014，35(16)： 208LIU QQ，ZHOU W，WANG B， et al. Research method of directdetermination o f v itamin C b y ultra p erformance c o nvergence chromatography [J ]. Food Sci， 2014， 35(16)：208 ) ( [14] MEJEAN M， BRUNELLE A， TOUBOUL D. Quantification oftocopherols and tocotrienols in soybean oil b y supercritical fluidchromatography coupled to high-resolution mass spectrometry [J ].Anal Bioanal Chem，2015，407(17)：5133 ) ( T AGUCHI K， FUKUSAKI E，BAMBA T. Simultaneous analysis for water-and f a t-soluble vitamins by a no v el si n gle hr o matography technique unifying supercritical liuid chromatography and liquid chromatography [J ] . J Chromatogr A， 2014 ， 1362：270 ) ( [16] K HATER S， W EST C. Deve l opment and validation of a supercritical fluid chromatography me t hod for the direct determination of e n antiomeric purity of provitamin B 5 in cosmetic formulations wi t h mass spectrometricdetection [J ]. J Pharm Biomed Anal，2015，102：321 ) ( [17] MATSUBARA A，UCH I KATA T，SHINOHARA M， et al. Highly sensitive and rapid profiling method fo r ca r otenoids and the i r epoxidized products using supercritical fluid chromatography coupled with electrospray ionization-triple quadrupole mass spectrometry[J ]. J Biosci Bioeng， 2012， 113(6)：782 ) ( [18] 林春花，谢贤清，范乃立，等.超高效合相色谱-质谱法快速分析食用植物油中常见脂肪酸[J].色谱，2015，33(4)：397 LING CH，XIE XQ，FAN NL， e t al. Fa s t analysis of common fattyacids in edible vegetable oils by ultra-performance convergencechromatography-mass spectrometry [J ] . Chin J Chromatogr， 2 015，33(4)：397 ) ( [19] 林春花，范乃立，芮培欣，等.超高效合相色谱-质谱法快速检测工业油酸中5种常见的脂肪酸[J].分析化学，2015，43(1)：75 LING CH， FAN NL， RUI PX， et al. Rapid detection of five commonfatty acids in industrial oleic acid based on ultra performanceconvergence chromatography-mass spectrometry [J] . C hin J AnalChem，2015，43(1)：75 ) ( [20] ACHEAMPONG A， LEVEQUE N，TCHAPLA A， et al. Si m ple complementary liquid chromatography and mass s pectrometry approaches f o r the characterization o f t r iacylglycerols in Pinus koraiensis seed oil[ J ]. J Chromatogr A， 2011，1218(31)：5087 ) ( [21] L I SA M， HOLCAPEK M. Triacy l glycerols profiling in pla n t oilsimportant in f ood i ndustry， dietetics and c osmetics using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemicalionization mass spectrometry [J]. J Chromatogr A， 2008， 1198- 1199：115 ) ( [22] 上 HOLCAPEK M，DVORAKOVA H， LISA M， e t al. Regioisomericanalysis of triacylglycerol s usin g silver-ion liquid chromatography- atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry：Comparison of five different mass analyzers [J ]. J Chromatogr A， 2010，1217(52)：8186 ) ( 23 LESELLIERA E，LATOS A，OLIVERIRA AL. Ultra high efflciency/ low p ressure s u percritical fluid chromatography wit h sup e rflciallyporous particles for triglyceride s eparation [J]. J C h romatogr A， 2014，1327：141 ) ( [24」 LEE JW， NAGAI T， GOTOH N， et al. P ro f lling of regioisomeric triacylglycerols in edible oils by supercritica l fluid chromatography/ tandem mass spectrometry[J ] . J Chromatogr B， 2014， 966： 193 ) ( [25 ] A SHRAF KM， YANG J， RAINVILLE P， et al. Ultra high performance supercritical f l uid c h romatography of l ip o philic compounds with application to synthetic and commercial bio d iesel [J]. J Chromatogr B， 2015，983-984：94 ) ( [26] FRANCOIS I， SANDRA P. Com p rehensive supercritical fl u id chromatography x reversed phase liquid ch r omatography for t he analysis of the fatty acids in flsh oil [ J ] . J Chromatogr A， 2009， 1216(18)：4005 ) vef4o? s ( [27] F FRANCOIS I，PEREIRA A S ，SANDRAP. Con s iderations on comprehensive and off-line s u percritical f luid chromatography x reversed-phase liquid c hromatography f o r t h e analysis o f t riacylglycerols in flsh oil [ J ] . J Sep S ci，2010 ， 33(10) ： 1504 ) ( [28] GAO L ， ZHANG J，ZHANG WB， et al. Integration of normal p h ase liquid chromatography with supereritical fluid chromatography f or analysis of fruitin g bodies of Ganoderma lucidum [J]. J Sep S c i，2010，33(23-24)：3817 ) ( [29] 杨敏，周萍，徐路，等.茱茱萸中吴茱萸次碱与吴茱萸碱含量的超临界流体色谱法测定[J].分析测试学报，2010，29(7)：743 YANG M，ZHOU P， X U L， et al. Determination of rutaecarpineand e vodiamine in Evodia r u taecarpa b y s u percritical f luid chromatography[J ]. J Instrum Anal，2010，29(7)：743 ) ( [ 30] 李振宇，傅青，李奎永，等.超临界流体色谱对吴茱萸中吲哚类生 物碱的快速分析[J].色谱，2014，32(5)：506LI ZY， FU Q， LI KY， et al . Fast analysis of indole alkaloids fromEvodiae Fruct u s by supercritical f luid chromatography[J ]. Chin J Chromatogr， 2014，32(5)：506 ) ( [31] F F U Q， LI Z Y ， SU N CC， et al. Rapid and sim u ltaneous analysis ofsesquiterpene pyridine alkaloids from T ripterygium wilfordii Hook.f. Using supercritical fluid chromatography-diode array detector-tandem mass spectrometry [ J ]. J Supercrit Fluids，2015，104：85 ) ( [32] WEST C， LESELLIER E. Eff e cts of mobile phase composition on retention and selectivity in achiral supereritical f l uid chromatography[J]. J Chromatogr A， 2013， 1302：152 ) ( [ 3 3] G AN ZERA M. Supercritical fluid chromatography for the separationof isoflavones [ J ]. J Pharm Biomed Anal， 2015，107：364 ) ( [34] DESMORTREUX C， ROTHAUPT M， WEST C， et al. Improvedseparation of f u rocoumarins of e ss e ntial oil s by s upercritical flui d chromatography [ J ]. J Chromatogr A，2009，1216(42)：7088 ) ( [35 邓亮，郭亚东，杨敏，等.超临界流体色谱同时测定厚朴中厚朴酚和和厚朴酚[J].天然产物研究与开发，2013，25(12)：1696 DENG L，GUO YD， YANG M， et al. Simultaneous determination ofhonokiol and magnolol in Ma g nolia officinalis by supercritical fluidchromatography [J]. Nat Prod Res Dev， 2013，25(12)：1696 ) ( |36 LESELLIER E，DESTANDAU E，GRIGORAS C， et al. F ast separation of triterpenoids by s u percritical f l uid chromatography/evaporative light seattering detector [ J ]. J Chromatogr A， 2012， 1268：157 ) ( [37] SAMIMI R， XU WZ， ALSHARARI Q，et al. Supercritical fluid c hromatography of North Am e rican gin s eng extr a ct [J]. J Su p ercritFluids，2014，86：115 ) ( 38 ] SCHAFFRATH M， WEIDMANN V， M AISON W. Enantioselective high performance liquid chromatography and sup e rcritical fluidchromatography separation of spirocyclic terpenoid flavor compounds [J].J Chromatogr A， 2 014， 1363：270 ) ( 39] QIAO X， AN R， HUANGY， et al. Separation of 25R/S-ergostane triterpenoids in the medicinal mushroom Antrodia camphorata usinganalytical supercritical-fluid chromatography[J]. J Chromatogr A， 2014，1358：252 ) ( SA NCHEZ HL，BERNAL JL， NOZAL MJD， e t al. Chir a l ana l ysisof aromatic amino acids in food supplements using subcritical f l uidchromatography and chirobiotic T2 column [J]. J Supercrit Fluids， 2016，107：519 ) ( 41] FRENKEL J， WESS C，VYVERMAN W，et al. Chiral separation of adiketopiperazine pheromone from marine diatoms using supercriticalfluid chromatography[J ] . J Chromatogr B， 2014，951-952：58 ) ( 42 M ONTANES F，CATCHPOLE OJ，TALLON S， et al. Semi-preparative s upercritical c hromatography sc a le plant forpolyunsaturated fatty acids purification [J]. J Supercrit F l uids，2013，79(10)：46 ) ( 43 吕惠生，莫绪飞，张敏华，等.超临界流体色谱纯化柠檬酸[J] . 食 品工业科技，2012，33(7)：271LU HS， M O XF ， ZHANG MH， et al. Study on purification of citricacid by supercritical fluid chromatography [ J].Sci Tech Food Ind，2012，33(7)：271 ) ( [ 44] G ARCIA-RISCO MR， VICENTE G，REGLERO G，et al.Fractionation of thyme( Thymus vulgaris L.) by supercritical f l uid extraction and chromatography[J]. J Supercrit Fluids， 2011， 55 (3)：949 ) ( 45 VICENTE G.GARCIA-RISCO MR， F ORNARI T， et al. Isolationof carsonic acid from rosemary extracts using semi-preparativesupercritical fluid chromatography [ J]. J Chromatogr A， 2013， 1286：208 ) ( [46 ] Z HAO Y ， MCCAULEY J，PANG X， et al. An a lytical a nd semipreparative separation of 25 (R/S)-spirostanol saponin diastereomers u s ing super critical fluid chromatography [J ]. J SepSci， 2013，36(19)：3270 ) ( (本文于2015年11月18日收到) ) 免费论文查重，传递门>> http：//free.paperyy.com 阅读此文的还阅读了： 1.超临界流体色谱在药物分析中的应用 2.超临界流体色谱在手性分离中的应用 3.超临界流体萃取技术在天然产物研究中的应用 4.高效逆流色谱研究进展——在天然产物有效成分分离方面的应用 5.超临界流体萃取技术在天然产物加工中的应用 6.超临界流体技术在天然产物萃取和分析上的应用 7.超临界流体色谱进展 8.毛细管电泳及其在天然产物分离分析中的应用进展 9.超临界流体萃取在天然药物分析中的应用 10.超临界流体色谱及超临界流体提取技术在农药分析中的应用 药物分析杂志 cbe lolg药物分析杂志 脂肪酸和甘油酯均拥有较长的烃链，不溶于水，都是弱极性成分。常用GC法分析脂肪酸，但GC法样品需要衍生化，前处理过程复杂。而SFC分析脂肪酸时无需进行衍生化处理，方法简单。林春花等建立了UPC2-MS方法快速分析棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸5种常见脂肪酸的方法，并且成功应用于玉米油、葵花籽油、橄榄油、茶油、大豆油和花生油中常见脂肪酸[1] 以及工业油酸中5种脂肪酸的含量测定[2] ；文中采用ACQUITY UPC2 BEH 2-EP色谱柱，以甲醇-乙腈(1:1，v/v)为改性剂，梯度洗脱，在电喷雾负离子模式下进行检测，外标法定量，在3 min内完成了各样品中脂肪酸的含量测定。已有的分析甘油酯的方法有HPLC法和银离子色谱法。HPLC法使用非水的流动相进行洗脱，分析时间长，等度洗脱时间需近300 min，梯度洗脱时间仍需140 min [3-4] ；银离子色谱法分析甘油酯时所需的柱平衡时间长，峰形差，重现性差[5]。甘油酯类化合物的同分异构体较多，尤其是双键位置异构的甘油酯异构体分离难度大。而利用SFC分析甘油酯时分析时间短，分离效果好，异构体也能得到有效的分离。Lesellier等[6]采用4根Kinetex C18(150mm×4.6 mm，2.6μm)柱串联15cm的Accucore C18色谱柱，乙腈-甲醇(90:10，v/v)为改性剂，在60min内分析了坚果油和油菜籽油样品并很好地分离样品中的酰基甘油对映体。Lee等[7]利用SFC-MS采用C30色谱柱YMC carotenoid柱，含0.1% 甲酸铵盐的甲醇为改性剂进行梯度洗脱，较好地分离了食用油样品中的甘油酯同分异构体。Ashraf-Khorassani等[8]利用SFC-MS以ACQUITY UPC2 HSS C18 SB(150mm×3.0mm，1.8μm)柱为分析柱，乙腈为改性剂，2%～20% 乙腈的洗脱梯度，快速分析了大豆油、玉米油、芝麻油及西红柿籽油样品中的三酰基甘油成分，并能检测样品中的微量杂质，为纯化工艺的优化提供依据。虽然Lesellier， Lee和Ashraf-Khorassani采用SFC分析甘油酯时所用的色谱柱柱长、粒径和种类均不相同，但是选择的色谱柱都是长链烷基键合固定相，有较高的碳含量和较好的疏水性。除色谱柱外，流动相中改性剂的种类和比例对甘油酯的保留和分离也有较大的影响。因此，色谱柱的选择和流动相的优化都SFC能够较好地分析甘油酯的关键。SFC不仅可以单独分析脂肪酸和甘油酯类成分，还能和HPLC串联成二维色谱完成对复杂样品的分析。Frangois等[9]采用在线SFC×HPLC二维色谱成功地分析了鱼油样品中的脂肪酸类成分，并与HPLC×HPLC色谱进行了对比。HPLC×HPLC色谱的峰容量(90)明显小于SFC×HPLC色谱的峰容量 (550)。由此可见，SFC×HPLC二维色谱的正交性更强，互补性更好，优势更加明显。Frangois等[10]还采用了离线SFC×HPLC二维色谱分析了鱼油样品中复杂的甘油酯类成分，并且有效地分离了甘油酯同分异构体。 Gao等[11]利用HPLC X SFC二维色谱分析了灵芝子实体中低极性化合物(如脂肪酸等)。