药用肥皂中异丙基甲基苯酚检测方案(液相色谱仪)

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Application No.L586News http：//www.shimadzu.com.cn第一版发行行：2020年11月 ApplicationNews 高效液相色谱分析仪 NexeraTM lite、Nexera XR 使用反相色谱法分析药用肥皂中的有效组分异丙基甲基苯酚 No.L586 岩田奈津纪 对用户的好处 ◆使用反相色谱法可以分离异丙基甲基苯酚(IPMP) 和对羟基苯甲酸丁酯(分离度为2以上) 厚生劳动省限制的 IPMP添加量(0.1~0.5%)可由荧光和紫外可见检测器检出 高速分析可削减约50%的分析时间、约40%的流动相消耗量 前言 异丙基甲基苯酚标准溶液的分析 2015年，欧洲化学品管理局(ECHA)停止销售含有三氯生的抗菌肥皂”，2017年，美国食品药品监督管理局(FDA)停止销售含有三氯生等19种组分的抗菌肥皂。日本厚生劳动省(MHLW)也追随这一措施，发出通知要求更换为替代产品。而替代产品所采用的具有代表性的组分即为异丙基甲基苯酚(IPMP)。 IPMP是一种具有杀菌、抗菌、抗氧化作用的组分，现今为多数医药部外品和化妆品等产品使用，是药用肥皂的有效组分。MHLW 限制其添加量为0.1~0.5%5，分析时采用荧光检测器。药用肥皂不在香料与化妆品测试方法范围之内，但是参考MHLM测试方法，其中指定了荧光检出条件。方法中同时指出IPMP添加量为0.25%以上的浓度时，可以使用紫外-可见(UV)检测器。 参考香料与化妆品测试标准，含有对羟基苯甲酸酯(羟苯丁酯)作为防腐剂的产品，使用反相色谱法(反相模式)可能出现IPMP与对羟基苯甲酸丁酯的色谱峰重叠的情况，推荐采用正相色谱法(正相模式)“。但是，正相模式与反相模式相比不易使用。 本文使用 Shim-packTM GIST C18， 在反相模式下分离这些组分能够达到2及以上的分离度。同时，通过荧光检测器可实现比UV检测器高约20倍的高灵敏度。此外，通过使用粒径2 um 的高效分析色谱柱，实现与粒径5um的色谱柱相比分析时间减少约50%，流动相消耗量减少约40%。 本文参考香料与化妆品测试法探讨IPMP分析及其高效化。分析条件如表1、2所示。使用荧光检测器 (RF-20AXS)及发光二极管阵列(PDA) 检测器 (SPD-M40) 采集的色谱图如图1所示。两图均为上图是使用粒径5um的分析色谱柱、Shim-packGIST C18 采集的色谱图，下图是使用同系列高效分析色谱柱(粒径2um)采集的色谱图。通过使用高效分析色谱柱，实现分析时间减少约50%，流动相消耗量减少约40%。 图1IPMP标准溶液(5mg/L)的色谱图 表1分析条件(粒径5um) 系统 Nexera lite 柱 Shim-pack GIST C18*1 (250× 4.6 mm l.D.， 5 pm) 流速 1.0 mL/min A)水 流动相 B)乙腈 B.浓度50% 柱温 40℃ 进样量 ： 10 pL 瓶 SHIMADZU LabTotalTM， 用于 LC 1.5 mL， 玻璃材质 检测(PDA)： SPD-M40， 278 nm 检测(FL) ： RF-20AXSEm： 280 nm， Ex： 305 nm *1 P/N： 227-30017-08*2 P/N： 227-34001-01 表2分析条件(粒径2um) 系统 ：Nexera XR 柱 ： Shim-pack GIST C18*3 (150×3.0 mm I.D.， 2 um) 流速 ：0.8 mL/min A)水 流动相 ：B)乙清 B.浓度50% 柱温 ：MR 180 uLⅡI 进样量 ：40°C 瓶 ：4uL 检测(PDA) ：SHIMADZU LabTotalTM，用于LC 1.5 mL， 玻璃材质 检测(FL) ： S：PD-M40， 278 nm RF-20AXS ： Em： 280 nm，Ex： 305 nm *3 P/N： 227-30002-05 |异丙基甲基苯酚与羟苯丁酯的分离 参考香料与化妆品测试法，含有对羟基苯甲酸酯(羟苯丁酯)作为防腐剂时，使用反相模式可能出现两者分离不充分的情况，推荐采用正相模式。但是，众所周知，正相模式与反相模式相比不易使用，例如色谱柱平衡时间长，基线不易稳定等。图2所示为使用RF-20AXS 分析的 IPMP 与对羟基苯甲酸丁酯混合标准溶液色谱普。使用 Shim-pack GIST C18， 在反相模式下能够成功分离这两个组分，分离度可以达到2甚至以上(表3)。 mV 图2IPMP与对羟基苯甲酸酯混合标准溶液(25mg/L) 的色谱图 表 3IPMP与羟苯丁酯的分离度 柱 检测器 分离度 Shim-pack GIST C18(粒径：5pm) RF-20AXS 12.3 SPD-M40 2.3 Shim-pack GIST C18(粒径：2pm) RF-20AXS 2.0 SPD-M40 2.2 标准曲线 各自分析条件下 0.5~10 mg/L的标准曲线如图3所示。该浓度相当于实际试样中含量的 0.025~0.5%。两者均得到了相关系数 R2=0.9999 以上的良好线性。 Shim-pack GIST C18 (粒径5 um)1)Shim-pack GIST C18(粒径2um) 图3测量线 RF-20AXS 与 SPD-M40 的灵敏度比较 RF-20AXS 与 SPD-M40检测器使用ASTM法计算出的IPMP(2mg/L) S/N 如表4所示。此外，这些检测器获得的色谱图比较如图4所示。该浓度相当于实际试样中含量的0.1%，即MHLW允许的最低含量。RF-20AXS的灵敏度高于 SPD-M40约20倍。此外，即使使用 SPD-M40时，方法的定量下限也低于 MHLW 允许加入的最低浓度。 20.0 min 图4IPMP标准溶液(2mg/L) 的色谱图比较 表4IPMP (2 mg/L) 的S/N比较 柱 检测器 S/N*4 Shim-pack GIST C18(粒径：5pm) RF-20AXS 6289 SPD-M40 317 *4ASTM，范围：15-25min， 间隔： 0.5 min |重现性 表5所示为1 mg/L标准溶液重复分析6次时的保持时间与面积的重现性(%RSD)。所有分析的保持时间、面积结果的重现性均在1%下。此外，能够以高灵敏度检出的 RF-20AXS 的面积重现性好于 SPD-M40。 表5重复分析6次时的重现性(%RSD) 柱 检测器 保持时间 面积 Shim-pack GIST C18(粒径：5 pm) RF-20AXS 0.04 0.13 SPD-M40 0.04 0.79 Shim-pack GIST C18(粒径：2pm) RF-20AXS 0.12 0.17 SPD-M40 0.13 0.49 药用肥皂中异丙基甲基苯酚的分析 试样采用4种市售药用肥皂。前处理方法参考香料与化妆品测试法。图5所示为前处理方案。通过甲醇溶剂提取药用肥皂，使用 0.2 um 的膜过滤器过滤后，以甲醇稀释，供HPLC分析。 图6所示为使用粒径5pm色谱柱采集的色谱图，图7所示为使用粒径 2um色谱柱采集的色谱图。此外，仅仅示使用RF-20AXS 的结果。所有分析当中IPMP均与其他组分成功分离。此外，药用肥皂C中检出对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。 根据定量结果计算出药用肥皂中的 IPMP含量。药用肥皂中的 IPMP含量如表6、7所示，分别为使用 5um 和2um 色谱柱测试结果。所有的分析测得的 0.1g/100g 或 0.1%IPMP含量几乎相同，在之前提到的不同方法和不同检测器之间不存在明显差异。表6药用肥皂中的 IPMP 含量 表6药用肥皂中的IPMP含量Shim-pack GIST C18 (粒径5pm) 浓度 含量 mg/L g/100 g %*5 RF-20AXS SPD-M40 RF-20AXS SPD-M40 RF-20AXS SPD-M40 药用肥皂A 2.04 2.04 0.100 0.100 0.1 0.1 药用肥皂B 2.08 2.08 0.102 0.102 0.1 0.1 药用肥皂C 2.05 2.06 0.102 0.102 0.1 0.1 药用肥皂 D 2.06 2.05 0.101 0.101 0.1 0.1 *5日本MHLW的含量限制：0.1~0.5%。 表7药用肥皂中的IPMP含量Shim-pack GIST C18 (粒径2 pm) 浓度 含量 mg/L g/100 g % RF-20AXS SPD-M40 RF-20AXS SPD-M40 RF-20AXS SPD-M40 药用肥皂A 2.04 2.04 0.100 0.100 0.1 0.1 药用肥皂B 2.09 2.08 0.103 0.102 0.1 0.1 药用肥皂 C 2.05 2.04 0.101 0.101 0.1 0.1 药用肥皂D 2.05 2.05 0.100 0.100 0.1 0.1 图5预处理方案 图6药用肥皂的色谱图(粒径5pm色谱柱、RF-20AXS) 图7药用肥皂的色谱图(粒径2pm色谱柱、RF-20AXS) 使用UV光谱确认 使用 SPD-M40 等 PDA检测器时，除色谱峰的保持时间之外，还可根据色谱峰与标准品 UV光谱的一致性进行鉴定。 使用 SPD-M40分析的药用肥皂A与标准品的色谱图如图8所示。 Nexera、 Shim-pack 和 SHIMADZU LabTotal 是岛津制作所株式会社在日本与其他国家的商标。 此外，图8中所得药用肥皂A中含有的保留时间11分钟左右的UV光谱与标准品 UV光谱的重叠图如图9所示。对各 UV光谱进行了标准化处理，以便进行比较。药用肥皂A及标准品均在279 nm 检出极大吸收波长，因此可鉴定药用肥皂A的11分钟左右色谱峰为 IPMP。 图8药用肥皂的色谱图(SPD-M40) 图9与UV光谱的比较 (SPD-M40) 结论 有关使用反相模式进行药用肥皂中IPMP分析，比较了两种检测方法，并且探讨了高效化分析。此次分析的试样中均不含有羟苯丁酯，因此使用混合标准溶液确认 IPMP与羟苯丁酯的分离后发现，使用 Shim-pack GIST C18 可以达到2以上的分离度。此外，荧光检出器比 UV检测器高约20倍的灵敏度。并且 UV检测器也可定量分析添加量达到下限浓度0.1%的样品，以及可以根据UV光谱将 IPMP与其他组分分离确认。因此，分析时可以使用PDA 检测器提高鉴定精度，使用荧光检测器进行高灵敏度分析。并且通过使用同系列的高效分析色谱柱，在确保分离的情况下，实现分析时间及流动相消耗量分别减少约50%和约40%。 ( <参考文献> ) ( 1 )ECHA，Re g ulation (EU) No 5 2 8/2012 concerning the making a v ailable onthe market and u s e o f biocidal products (2015) ) ( 2 ) FDA， FDA issues final r u le on safety and effectiveness of antibacterial soaps (2016) ) ( 3)厚生劳动省有关药用肥皂的使用方法等(2016年9 岛 月30日药生药审发0930第4号及药生安发 津应用 云 0930第1号) ) ( 4)日本药学会编、卫生试验法·注解2015、692-693、2015、金原出版 ) 5)厚生劳动省有关药用肥皂批准审查的注意事项 (2018年3月29日药生药审发0329第13号) ( 免责声明： ) 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 用户服务热线电话： 800-810-0439 ) 2015年，欧洲化学品管理局（ECHA）停止销售含有三氯生的抗菌肥皂1)，2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）停止销售含有三氯生等19种组分的抗菌肥皂2)。日本厚生劳动省也追随这一措施，发出通知要求更换为替代产品3)。而替代产品所采用的具有代表性的组分即为异丙基甲基苯酚（IPMP）。参考香料与化妆品测试标准，含有对羟基苯甲酸酯（羟苯丁酯）作为防腐剂的产品，使用反相色谱法（反相模式）可能出现IPMP与对羟基苯甲酸丁酯的色谱峰重叠的情况，推荐采用正相色谱法（正相模式）4)。但是，正相模式与反相模式相比不易使用。本文使用Shim-pack™ GIST C18，在反相模式下分离这些组分能够达到2及以上的分离度。同时，通过荧光检测器可实现比UV检测器高约20倍的高灵敏度。此外，通过使用粒径2μm的高效分析色谱柱，实现与粒径5μm的色谱柱相比分析时间减少约50%，流动相消耗量减少约40%。