肉类样品中氟苯尼考检测方案(液相色谱仪)

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材料与方法 依据日本肯定列表使用 SPE 柱及LC-MS/MS对肉类样品中的兽药(I)和(II)进行多残留分析 应用报告 食品与农业 作者 Eugene Chang， Kazuyuki Yamashita 和Ritu Arora 引言 安捷伦科技有限公司 25200 Commercentre Drive Lake Forest， CA92630 美国 相当于美国FDA的日本厚生劳动省(MHLW)于2006年5月29日起开始实施日本肯定列表制度，用以限定食品中的农业化学品[1]。此项法规的颁布旨在禁止含有超过最大残留限量(MRL) 农业化学品的化学污染食品流入市场。农业化学品包括农药、饲料添加剂和兽药。该法规适用于所有国产和进口食品，涉及近800种化学品。由于日本是西太平洋/大洋洲地区的最大进口国，所以大多数食品出口国必须遵守此准则。此法规的检验方案采用经典的 SPE 柱和 LC/MS或 GC/MS技术，要求农业化学品的残留量不超出MRL(通常为 0.01 ppm)。 本文描述了不同肉类基质中45种中性、碱性和酸性兽药的分析，残留量均低于日本肯定列表规定的MRL(0.01 ppm)。通过采用Hydromatrix硅藻土 Bond Elut Plexa SPE柱、Pursuit C18 HPLC 色谱柱及 MS检测，安捷伦提供了肉药兽药测定的完整解决方案。 Agilent Technologies 为了便于检测和分离，将药物分为两组。组1主要由碱性化合物组成，而组2由酸性和碱性化合物组成。两组药物使用不同的LC和MS/MS 条件(方法(I)和方法(ⅡI)，见表1)进行分析，但采用相同的样品前处理方法。 表1.方法(1)和(/)中的分析物 方法(I) 方法(I) 2-氨基-5-丙磺酰基苯并咪唑 林可霉素 噻菌灵 磺胺醋酰 左旋咪唑 达氟沙星 磺胺嘧啶 赛拉嗪 磺胺噻唑 克伦特罗 甲氧苄啶 敌百虫(DEP) 磺胺吡啶 替米考星 奥美普林 息疟定 磺胺甲基嘧啶 氟苯尼考 甲砜氯霉素 2-乙酰氨基-5-硝基噻唑 磺胺二甲嘧啶 氯舒隆 磺胺甲氧哒嗪 氨磺磷 磺胺莫托辛 氢化可的松 磺胺氯哒嗪 泰妙菌素 磺胺多辛 地塞米松 磺胺地托辛 波尼松龙 磺胺甲基异噁唑 仲丁威(BPMC) 乙氧酰胺苯甲酯 埃玛菌素 磺胺喹噁啉 双硫磷(Abate) 磺胺硝苯 丙烯菊酯 β-群勃龙 莫能菌素 α-群勃龙 醋酸美仑孕酮 两种方法共同的样品前处理步骤 1 称取5g肉类样品 2. 加入100mL乙腈/甲醇/0.2%偏磷酸 (1：1：3)溶液，搅匀。并经含2-3 mm 厚 Hydromatrix 硅藻土的滤纸减压过滤。用20mL乙乙/甲醇/0.2%偏磷酸 (1：1：3)溶液冲洗硅藻土层。经含硅藻土的滤纸减压过滤 3. 合并滤液，并蒸发至20mL 4. 用5mL甲醇、5mL2%氨水活化 Bond Elut Plexa 柱，上样，用5mL 2%氨水淋洗，然后用5mL甲醇洗脱样品 5. 40°℃蒸干溶剂 6. 用1mL乙乙：水(1：9)溶液复溶样品 玉米赤霉醇 与日本肯定列表配合的动物产品中兽药的标准分析方法尚未发布。但是，已有政府推荐使用的检测方法，经过少许修改即为以下给出的方法(I)和方法(ⅡI)。样品用 Hydromatrix 硅藻土过滤，随后采用 Bond Elut Plexa SPE 柱进行前处理，可以有效消除基质干扰。当用乙腈/甲醇/偏磷酸混合溶液处理肉类样品时会使蛋白质变性，故必须使用Hydromatrix 等硅藻土产品来消除浑浊。用甲醇和2%的氨水活化 Bond Elut Plexa 柱，与通常使用甲醇和水活化不同，用氨水活化能够带来更高的回收率。 两种方法中大多数化合物均采用供应商提供的分析证书中的MRM 离子对进行分析，但有些情况下为了获得更好的灵敏度，采用了不同的监测离子。 所有分析物使用的 MS/MS离子对详细列于表2和3中。由于一些化合物在高温时不稳定，所以两种方法中均包括了干燥气的温度控制程序。 方法(I)LC条件方法(II)LC 条件流动相A 乙腈+0.1%甲酸溶液流动相A 乙腈+0.1%甲酸溶液流动相B 水+0.1%甲酸溶液流动相B 水+0.1%甲酸溶液柱温 40°C柱温 40°C梯度程序梯度程序时间 (min) %A %B 流速(pL/min)时间 (min) %A %B 流速(pL/min)0 5 95 2005 95 2002 5 95 20028 99 20030 80 20 20033 99 20034 80 20 20034 5 95 20035 5 95 20040 5 95 20040 5 95 200 方法(I)MS条件 化合物 母离子 子离子 ESI 模式 碰撞能量 2-氨基-5- 丙磺基苯并咪唑 240.1 133.1 21.5 噻菌灵 202.1 175.1 8.0 左旋咪唑 205.1 178.0 16.0 磺胺嘧啶 251.1 92.1 15.0 磺胺噻唑 256.0 156.0 6.0 甲氧苄啶 291.1 230.1 10.5 磺胺吡啶 250.0 156.2 13.5 奥美普林 275.1 123.1 14.0 磺胺甲基嘧啶 265.1 155.9 11.5 甲砜氯霉素 356.0 308.0 8.0 磺胺二甲嘧啶 279.1 92.1 19.0 磺胺甲氧哒嗪 281.1 156.1 14.5 磺胺莫托辛 281.1 156.1 14.5 磺胺氯哒嗪 286.1 157.1 8.0 磺胺多辛 311.1 156.2 17.5 磺胺地托辛 311.1 156.2 17.5 磺胺甲基异噁唑 254.0 155.9 12.0 乙氧酰胺苯甲酯 238.2 136.0 15.0 磺胺喹噁啉 301.0 155.9 12.0 磺胺硝苯 336.1 134.1 19.5 β-群勃龙 271.1 165.1 38.0 α-群勃龙 271.1 165.1 38.0 醋酸美仑孕酮 397.2 279.1 14.0 玉米赤霉醇 321.1 277.1 21.0 表3.方法(M/)MS/MS 离子对详情 化合物 母离子 子离子 ESI模式 碰撞能量 林可霉素 407.2 126.1 19.5 磺胺醋酰 215.0 156.0 11.0 达氟沙星 358.1 340.1 18.5 赛拉嗪 221.1 90.1 10.5 克伦特罗 278.2 204.1 敌百虫(DEP) 259.0 109.1 替米考星 435.6 143.0 14.0 息疟定 249.1 177.1 19.0 氟苯尼考 355.9 184.9 18.0 2-乙酰氨基-5-硝基噻唑 186.0 138.9 13.0 氯舒隆 379.9 343.9 10.5 氨磺磷 326.0 93.1 20.5 氢化可的松 363.1 121.1 14.5 泰妙菌素 494.3 192.1 12.0 地塞米松 393.2 373.1 5.0 波尼松龙 361.2 147.0 13.0 仲丁威(BPMC) 208.1 95.1 10.5 埃玛菌素 887.5 158.1 19.0 双硫磷(Abate) 467.0 419.3 19.5 丙烯菊酯 303.0 135.0 7.0 莫能菌素 693.4 675.2 30.5 结果与讨论 图1和图3显示了方法(I)和方法(ⅡI)中标准品LC-MS/MS分析的总离子流和 MRM 色谱图。Pursuit C18 色谱柱使方法(I)中三对同分异构体均达到基线分离。这表明LC的强大性能已经使MS检测能力显得捉襟见肘。两种方法使用相同的色谱柱进行分离。总之，该色谱柱非常适用于兽药多残留分析。 响应强度 噻菌灵 202.1>175.1[-8.0V] 2-氨基-5-丙磺酰 基苯并咪唑 240.1>133.1[-21.5V] 左旋咪唑 205.1>178.0[-16.0V] 磺胺嘧啶 251.1>92.1[-15.0V] 磺胺噻唑 256.0>156.0 [-6.0V] 甲氧苄啶 291.1>230.1[-10.5V] 磺胺吡啶 250.0>156.2[-13.5V] 奥美普林 275.1>123.1[-14.0V] 磺胺甲基嘧啶 265.1>155.9 [-11.5V] 甲砜氯霉素 356.0>308.0[-8.0V] 磺胺二甲嘧啶 279.1>92.1[-19.0V] 磺胺甲氧哒嗪 281.1>156.1[-14.5V]与磺胺莫托辛 UL 磺胺氯哒嗪 286.1>157.1[-8.0V] 311.1>156.2[-17.5V] 磺胺多辛与磺胺地托辛 磺胺甲基异噁唑 254.0>155.9 [-12.0V] 238.2>136.0[-15.0V] 乙氧酰胺苯甲酯 磺胺喹噁啉 301.0>155.9[-12.0V] 磺胺硝苯 336.1>134.1[-19.5V] 2β-群勃龙与a-群勃龙71.1>165.1[-38.0V] 321.1>227.1(-)[21.0V] 玉米赤霉醇 醋酸美仑孕酮 397.2>279.1[-14.0V] 5 10 15 20 25 30 35 min 图1.使用 Agilent Pursuit C18 色谱柱进行方法(I)中标准品的LC-MS/MS分析的总离子流色谱图和 MRM 色谱图 图2和图4是方法(I)和(ⅡI)中标准品的10 ppb 混合物和加标基质(鸡肉、猪肉和牛肉)的总离子流色谱图。每种肉类基质净化后谱图差异极小，显示出 Bond Elut Plexa 柱拥有极佳的净化能力。 使用 Bond Elut Plexa 柱对加标 10 ppb 的鸡肉、猪肉和牛肉进行前处理，两种方法所涉及的所有分析物的回收率及 RSD 值列于表4和表5中。该方法的重现性良好，大多数化合物的 RSD 值小于1%，最大的 RSD 值也仅为3.6%。所有药物的回收率在65%-115%之间，大多数药物的回收率在 75%-100%范围内。这些回收率结果均符合EU 和 CDFA的要求[2]。 图2.对方法(I) 中 10 ppb标准品混合物和加标基质(鸡肉、猪肉和牛肉)进行定量分析的总离子流色谱图 响应强度 400- 300 200 100- 0 磺胺醋酰 215.0>156.0 [-11.0V] 达氟沙星 358.1>340.1[-18.5V] 赛拉嗪 221.1>90.1[-10.5V] 克伦特罗 278.2>204.1[-9.5V] 敌百虫(DEP) 259.0>109.1[-9.5V] 替米考星 435.6>143.0[-14.0V] 息疟定 249.1>177.1[-19.0V] 氟苯尼考 355.9>184.9(-)[18.0V] 2-乙酰氨基-5-硝基噻唑 186.0>138.9 (-)[13.0V] 氯舒隆 379.9>343.9 (-)[10.5V] 波尼松龙 361.2>147.0[-13.0V] 氢化可的松 363.1>121.1[-14.5V] 泰妙菌素 494.3>192.1[-12.0V] 地塞米松 393.2>373.1 [-5.0V] 氨磺磷 326.0>93.1[-20.5V] 埃玛菌素 208.1>95.1[-10.5V] 仲丁威(BPMC) 887.5>158.1[-19.0V] 双硫磷(Abate) 467.0>419.3[-19.5V] 丙烯菊酯 303.0>135.0[-7.0V] 莫能菌素 693.4>675.2[-30.5V] 图4.对方法(/)中 10 ppb标准品混合物和加标基质(鸡肉、猪肉和牛肉)进行定量分析的总离子流色谱图 图3.使用 Agilent Pursuit C18 色谱柱进行方法(I/)中标准品的 LC-MS/MS分析的总离子流色谱图和MRM色谱图 表4.方法(1)： 使用 Agilent Bond Elut Plexa 柱对鸡肉、猪肉和牛肉中的兽药进行多残留萃取，于10 ppb检测限计算回收率 化合物 C(ppb) RSD 回收率(%) C (ppb) RSD 回收率(%) C (ppb) RSD 回收率(%) 2-氨基-5- 丙磺酰基苯并咪唑 10.0 0.8 100 8.4 0.5 84 8.6 0.2 86 噻菌灵 11.5 0.3 115 8.6 0.5 86 10.1 0.9 101 左旋咪唑 7.5 0.2 75 6.5 0.6 65 6.5 0.6 65 磺胺嘧啶 10.8 1.0 108 9.6 0.4 96 10.0 0.1 100 磺胺噻唑 7.8 0.3 78 7.8 0.9 78 7.0 0.5 70 甲氧苄啶 8.7 0.2 87 7.0 0.3 70 7.5 0.3 75 磺胺吡啶 8.4 0.0 84 8.5 0.2 85 8.1 0.5 81 奥美普林 9.1 0.1 91 7.6 0.1 76 7.9 0.7 79 磺胺甲基嘧啶 8.7 0.7 87 8.7 0.3 87 8.5 0.2 85 甲砜氯霉素 11.1 1.4 111 7.9 3.5 79 9.6 3.3 96 磺胺二甲嘧啶 9.6 1.9 96 9.0 0.9 90 8.5 0.8 85 磺胺甲氧哒嗪 8.9 0.2 89 8.3 0.2 83 8.1 0.2 81 磺胺莫托辛 9.9 1.1 99 9.8 0.8 98 8.9 1.0 89 磺胺氯哒嗪 10.0 0.7 100 8.4 0.6 84 9.6 1.4 96 磺胺多辛 10.3 1.0 103 9.4 0.2 94 9.2 0.4 92 磺胺甲基异噁唑 10.1 0.5 101 8.6 1.0 86 8.8 0.6 88 乙氧酰胺苯甲酯 11.2 3.6 112 11.3 2.0 113 10.0 0.4 100 磺胺喹噁啉 11.5 0.5 115 10.3 0.2 103 10.0 0.2 100 磺胺地托辛 9.6 0.7 96 10.1 0.5 101 9.5 0.6 95 磺胺硝苯 10.7 0.8 107 11.3 0.5 113 10.7 0.3 107 β-群勃龙 10.7 1.5 107 9.7 1.8 97 9.0 0.9 90 α-群勃龙 9.8 0.1 98 8.5 0.0 85 8.6 0.9 86 醋酸美仑孕酮 9.7 0.2 97 8.5 1.2 85 7.9 0.6 79 玉米赤霉醇 9.7 2.1 97 9.4 0.3 94 9.1 0.2 91 表5.方法(I)：使用 Agilent Bond Elut Plexa 柱对鸡肉、猪肉和牛肉中兽药进行多残留萃取，于10ppb检测限计算回收率 化合物 C (ppb) RSD 回收率(%) C (ppb) RSD 回收率(%) C (ppb) RSD 回收率(%) 林可霉素 8.8 1.5 88 7.3 1.6 73 9.7 0.5 97 磺胺醋酰 9.4 0.9 94 8.7 0.9 87 8.9 0.9 89 达氟沙星 11.3 1.5 113 10.2 1.5 102 10.5 1.1 105 赛拉嗪 10.8 0.5 108 10.6 1.3 106 9.6 0.8 96 克伦特罗 9.4 1.2 94 9.7 0.2 97 9.6 0.1 96 敌百虫(DEP) 8.4 0.4 84 7.2 0.2 72 7.5 0.2 75 替米考星 9.3 1.0 93 9.4 1.3 94 9.1 0.9 91 息疟定 10.0 0.9 100 10.1 0.3 101 9.8 0.5 98 氟苯尼考 10.6 0.1 106 9.9 0.5 99 10.3 0.5 103 2-乙酰氨基-5-硝基噻唑 9.5 0.5 95 9.8 1.0 98 9.7 0.7 97 氯舒隆 9.8 1.1 98 10.0 0.2 100 9.6 0.3 96 波尼松龙 10.2 1.0 102 9.9 1.0 99 9.9 0.6 99 氢化可的松 9.4 1.2 94 9.7 1.9 97 8.2 2.0 82 泰妙菌素 10.9 2.4 109 9.3 0.4 93 9.8 0.7 98 地塞米松 11.1 2.1 111 9.3 0.6 93 9.9 0.3 99 仲丁威(BPMC) 11.3 3.3 113 8.5 0.7 85 9.9 0.6 99 埃玛菌素 7.1 2.3 71 8.7 1.7 87 10.5 1.8 105 双硫磷(Abate) 9.1 1.3 91 9.1 1.3 91 9.8 0.2 98 氨磺磷 10.3 1.4 103 10.0 1.2 100 9.9 0.4 99 丙烯菊酯 10.8 1.5 108 9.6 2.2 96 9.2 1.2 92 莫能菌素 10.3 1.5 103 9.5 0.2 95 10.1 1.0 101 结论 本文开发了一种在多种肉类基质中，根据日本肯定列表中要求的MRL (0.01 ppm)范围，联合使用 SPE 和 HPLC 产品进行有挑战性的兽药多残留分析的全面解决方案。考查的肉类基质包括鸡肉、猪肉和牛肉。 采用两种方法，使用 SPE 柱和LC-MS/MS对45种化合物进行分析。利用 Hydromatrix 硅藻土过滤消除浑浊。Bond Elut Plexa柱净化样品基质得到了高重现性结果，大多数化合物的RSD 值均小于1%。同时，两种方法也表现出良好的回收率，大多数化合物的回收率均在75%-100%范围内。 Pursuit C18 色谱柱使方法(I)中的三对同分异构体均达到基线分离，表明LC的强大性能已经使MS检测能力显得捉襟见肘。Pursuit C18 色谱柱适用于兽药多残留分析。 本文开发的两种分析方法均满足或超过日本肯定列表设定的 10ppb 检测限的要求。两种方法均表现出灵敏度高、结果可靠、成本效益好的特点。 ( 参考文献 ) ( 1. Positive List System for Agricultural Chemical Residuesin Foods.http：//www.ffcr.or.jp. ) 2. Quality Control Procedures for Pesticide ResiduesAnalysis.SANCO/10232/2006，24 March 2006. http：//ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf 更多信息 这些数据代表了典型的结果。如需了解更多有关我们产品和服务的信息，请访问我们的网站 www.agilent.com/chem/cn。 www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本资料中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2011 ) ( 2011年9月27日，中国印刷 ) ( 5990 - 8986CHCN ) 相当于美国FDA 的日本厚生劳动省(MHLW) 于2006 年5 月29 日起开始实施日本肯定列表制度，用以限定食品中的农业化学品[1]。此项法规的颁布旨在禁止含有超过最大残留限量(MRL) 农业化学品的化学污染食品流入市场。农业化学品包括农药、饲料添加剂和兽药。该法规适用于所有国产和进口食品，涉及近800 种化学品。由于日本是西太平洋/ 大洋洲地区的最大进口国，所以大多数食品出口国必须遵守此准则。此法规的检验方案采用经典的SPE 柱和LC/MS 或GC/MS 技术，要求农业化学品的残留量不超出MRL（通常为0.01 ppm）。本文描述了不同肉类基质中45 种中性、碱性和酸性兽药的分析，残留量均低于日本肯定列表规定的MRL (0.01 ppm)。通过采用Hydromatrix 硅藻土、Bond Elut Plexa SPE 柱、Pursuit C18 HPLC 色谱柱及MS 检测，安捷伦提供了肉中兽药测定的完整解决方案。