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LAAN-A-LM125 ApplicationnNNo.C153News 第一版发行日:2017年5月400-650-0439 LC/MS 全自动前处理-LC/MS/MS 系统分析人血浆中抗心律失常药物 药物剂量控制在临床药物治疗过程中属于难点。例如治疗范围狭窄或疗效与毒性存在交叉。因此,患者的血药浓度的测定,决定了最佳给药剂量,以及基于药代动力学、药效学分析的个人药物治疗方案。“应用新闻C123”介绍了一款使用全自动前处理-高效液效色谱串联质谱 (LCMS)系统 CLAM-2000用于工作流程优化的相关研究。 本文使用该全自动前处理-LC/MS/MS 系统,对6种抗心律失常药物实现快速、同时分析。 S. Iwasaki 血浆中抗心律失常药物的全自动前处理分析 一般血浆样品的前处理,采用有机溶剂沉淀蛋白后,离心除去沉淀并分离上清。而全自动前处理 LC/MS/MS系统,在设置采血管后,即可全自动的进行上述前处理,并连续进行 LC/MS/MS分析(图1)。下一样品的前处理也可以与 LC/MS/MS分析同时进行,可大幅缩减单个样品分析时间。 在本文中,使用自动化前处理-LC/MS/MS对6种抗心律失常药物以及代谢产物进行同时分析,每个血浆样品的前处理和分析仅7分钟(表1和图2)。 图1血浆样品的前处理流程 Compound Molecular MRM Formula Transition m/z Amiodarone C25H29I2NOs 646.0>58.1 Desethylamiodarone* C23H25I2NOs 618.0>72.1 Bepridil C24HN2O 367.1>84.1 Flecainide C7H2oFN2O: 415.0>301.0 Pilsicainide C7H24N2O 272.9> 110.1 Cibenzoline CieHiaN 262.9>115.0 Mexiletine C.HNO 180.1>58.0 图2人血浆样品加标色谱图 l全自动前处理分析方法验证 采用对照血浆加标绘制校正曲线,并根据QC样品(n=5)分析结果,对准确度和精密度进行评价:(表2)。所有的抗心律失常药物在浓度范围内线性良好。QC样品的回收率,包括最低定量限,均处于100±15%的范围内。此外,精密度(%RSD)也位于15%的范围内,重现性良好。 在分析校正曲线的最高浓度样品后立即测量空白血浆,对全自动前处理 LC/MS/MS 系统中的残留进行了确认。与校正曲线中最低浓度样品的峰强度值相比,所有药物均未有明显的残留(图3)。 根据以上结果,本文所使用的全自动前处理 LC/MS/MS 系统在对样品进行连续分析时,具有线性范围宽,定量可靠的特点。 Compounds Cal. Range [ng/mL] Correlation Coefficient R Accuracy Precision %RSD,n=5 LLOQ LOW Medium High LLOQ LOW Medium High Amiodarone 100-3000 0.9983 98.3 100.6 99.4 103.9 4.1 2.9 3.0 2.7 Desethylamiodarone1 100-3000 0.9987 99.2 98.9 101.1 100.3 5.3 4.2 3.6 4.2 Bepridil? 50-1500 0.9992 100.9 100.5 96.6 103.4 4.1 3.7 2.3 1.8 Flecainide2 50-1500 0.9987 98.1 98.7 96.7 101.4 4.7 3.3 2.4 2.4 Pilsicainide 100-3000 0.9987 100.4 99.6 97.3 104.8 4.0 3.0 1.8 2.0 Cibenzoline2 50-1500 0.9987 102.4 101.4 99.1 102.9 4.2 3.4 3.0 2.4 Mexiletine 100-3000 0.9984 104.5 107.4 106.3 107.8 3.8 3.9 2.6 2.6 *1: 100 ng/mL for LLOQ, 250 ng/mL for Low, 1000 ng/mL for Medium, 3000 ng/mL for High *2: 50 ng/mL for LLOQ, 125 ng/mL for Low, 500 ng/mL for Medium, 1500 ng/mL for High min 图3残留确认试验结果 表3分析条件(方法学评价) System SCLAM-2000 +Nexera +LCMS-8060 Protocol Plasma disp. 15 pL-Acetonitrile disp. 285 pL-Shaking 1900 rpm, 120 sec- Filtration 90 sec Column Shimadzu GLC Mastro C18 (50 mmL.×2.1 mml.D., 3 pm) Mobile Phase A 0.1% Formic acid -Water, B 0.1% Formic acid -Methanolp Flow Rate 0.4 mL/min Time program B Conc. 10%(0 min)-100%(2-3.5 min)-10% (3.51-6min) . Column Temp. 50℃ injection Volume :0.2 pL Probe Voltage 2.0 kV (ESI-positive mode) Interface Temp 300℃ DL Temp. : 250℃ Block Heater Temp. 400℃ Nebulizing Gas Flow : 3 L/min Heating Gas Flow 10L/min Drying Gas Flow 10 L/min ■与手动前处理法之间的对比试验 对比了手动前处理法和全自动前处理 LC/MS/MS系统,用于血浆中胺碘酮浓度的测定。 手动前处理法通过手动分离血浆,添加乙腈,混合进行除蛋白。离心分离样品后,将上清转移至小瓶中进行 LC/MS/MS分析。另一方面,全自动前处理分析法从分离血浆到LC/MS/MS分析的全工艺流程均采用本报告中的系统自动进行(图4)。 Manual Pretreatment 对比不同方法之间,胺碘酮及其代谢产物一脱乙基胺碘酮的定量结果(图5、图6、表4和表5)。在较宽的浓度范围内,手动前处理法和全自动前处理分析法的定量结果具有良好的一致性。此外,根据上述结果计算的两种方法的相关系数R2≥0.95(图7和图8)。 本文所使用的全自动前处理分析法系统能得到与传统手动前处理法一致的定量结果,且更加迅速,降低实验人员负担,有相当乐观的应用前景。 Automated Pretreatment (x100,000) (x100,000) 1.0- 图5手动前处理人血浆(Sample3)分析结果 图6全自动前处理分析人血浆(Sample3) 分析结果 表4手动前处理和全自动前处理分析法的定量结果(碘酮) 表5手动前处理和全自动前处理分析法的定量结果.(脱乙基胺碘酮) Amiodarone Manual Automated Ratio%* [ng/mL] [ng/mL] Sample 1 373 411 110.2 Sample 2 399 404 101.3 Sample 3 546 557 102.0 Sample 4 205 211 102.9 Sample 5 963 895 92.9 Sample 6 1,318 1,213 92.0 Sample 7 1,271 1,229 96.7 Sample 8 1,233 1,282 104.0 Sample 9 2,259 2,208 97.7 Average 100.0 RSD% 5.8 Desethylamiodarone Manual Automated [ng/mL] Ratio %* [ng/mL] Sample 1 304 271 89.1 Sample 2 412 366 88.8 Sample 3 416 423 101.7 Sample 4 271 240 88.6 Sample5 717 654 91.2 Sample 6 151 150 99.3 Sample 7 431 408 94.7 Sample 8 664 628 94.6 Sample 9 940 1,080 114.9 Average 95.9 RSD% 8.9 * Automated Pretreatment/Manual Pretreatment *Automated Pretreatment/Manual Pretreatment AMD DEA [ng/mL] 图7胺碘酮的定量结果比较 图8脱乙基胺碘酮的定量结果比较 表6分析条件(前处理法对照试验) 致谢 本资料的研究过程中得到了国立心血管研究中心医院(国家研究开发局)药剂部岛本裕子老师的大力支持 参考文献 · Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation (2001, US FDA) ·药物研发过程中生物样品中药物浓度分析法的验证相关指南(2013年,厚生劳动省) 注) ·本文件中记载的产品未能基于医药品医疗器械法作为医疗器械获批。无法以治疗诊断为目的,无法通过正常程序使用。。本文件中记载的样品均由国立心血管研究中心医院采集和测量。我们已获得关于测量数据刊载的授权。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( 免责声明: ) *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售; ( *本资料中的所有信息仅供参考,不予任何保证。 如有变动,恕不另行通知。 ) 本文使用该全自动前处理-LC/MS/MS 系统,对6种抗心律失常药物实现快速、同时分析。一般血浆样品的前处理,采用有机溶剂沉淀蛋白后,离心除去沉淀并分离上清。而全自动前处理LC/MS/MS系统,在设置采血管后,即可全自动的进行上述前处理,并连续进行LC/MS/MS分析。下一样品的前处理也可以与LC/MS/MS分析同时进行,可大幅缩减单个样品分析时间。在本文中,使用自动化前处理-LC/MS/MS对6种抗心律失常药物以及代谢产物进行同时分析,实现了每个血浆样品的前处理和分析仅7分钟。根据对照血浆加标绘制校正曲线,并根据QC样品(n = 5)分析结果对准确度和精密度进行评价。所有的抗心律失常药物在浓度范围内线性良好。QC样品的回收率,包括最低定量限,均处于100±15%的范围内。此外,精密度(%RSD)也位于15%的范围内,重现性良好。
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