曲妥珠单抗中蛋白质N端氨基酸序列检测方案(生物质谱)

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SSL-CA14-715Excellence in Science Excellence in SciencePPSQ-005 应用蛋白质测序仪 PPSQ-53A测定曲妥珠单抗的N-末端氨基酸序列 PPSQ-005 摘要：本文使用 SDS-PAGE( 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)将曲妥珠单抗的重链和轻链进行分离后，通过电转印方法将凝胶上的样品转移到 PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)上，应用蛋白质测序仪 PPSQ-53A 分别测定重链和轻链的N-末端氨基酸序列，结果与理论序列一致，验证了此方法的准确性。 关键词：蛋白质测序仪 PPSQ-53A氨基酸序列抗体药物曲妥珠单抗赫赛汀 抗体药物作为一种具有独特优势的生物靶向性治疗药物，因其高度特异性及优越的药代动力学特性，在疾病的诊断和治疗中显示出其他类型药物无可比拟的优势，是目前全球药物研发的热点。作为一种蛋白质类药物，抗体药物一般注射给药，药品在储存过程中可能会发生降解和聚合，需要对其进行质量均一性评价以进行质量控制。ICH-Q6B (人用药品注册技术要求国际协调会三方协调指导原则质量标准：生物技术产品及生物制品的检测方法和验收标准)中明确规定蛋白质类药物申报需要提供N-末端氨基酸序列作为质量均一性评价的证据，生物仿制药相关规定(EMA)也要求生物仿制药 需要对N-末端氨基酸序列进行确认而且应与原研药相同。Edman降解法是目前直接进行N-末端氨基酸序列分析的主要方法，应用岛津公司的蛋白质测序仪 PPSQ-551A/53A，可以自动化实现Edman 降解反应，进行蛋白质和多肽N-末端的氨基酸序列测定。本文演示了应用蛋白质测序仪 PPSQ-53A 测定国内已经上市的代表性抗体药物-曲妥珠单抗(赫赛汀，临床上用于治疗乳腺癌)的N-末端氨基酸序列的方法及结果。该方法操作简单、检测灵敏可靠，可作为生物技术药物N-末端氨基酸序列分析的应用参考。 实验部分 1.1仪器 PPSQ-53A 1.2试剂和样品 5% phenyl isothiocyanate n-heptane solution (Wako， Code： 161-27341) 12% trimethylamine solution (Wako， Code： 200-20021) 25% trifluoroacetic acid (Wako， Code：204-20041) PTH-amino acids mobile phase (Wako， Code： 168-27351) Trifluoroacetic acid (Wako， Code： 207-20031) Wakopak Wakosil-II PTH-4.6×250 mm (Wako， Code： 235-63951) PTH-amino acids mixture standard(Wako， Code：165-27361) Ethyl acetate(Wako， Code： 052-09041) 1-chlorobutane(Wako， Code： 033-24371) 37% acetonitrile solution (Wako， Code： 018-26041) PVDF 膜(碧云天， Code： FFP32) 样品：注射用曲妥珠单抗原液(赫赛汀) 1.3样品前处理 取100 pmol样品进行 SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离后，电转印至PVDF膜上，使用丽春红染液进行染色，待自然晾干后分别剪切重链和轻链的条带，依次安装到反应器上进行分析，测试样品N-末端前15个氨基酸的序列。 图1曲妥珠单抗SDS-PAGE电转印结果 1.4 PPSQ分析条件 PVDF分析模式，循环数设置为16(第一个循环不参与反应) 结果与讨论 2.1 PTH-氨基酸混合标准品测试色谱图 为对19种PTH-氨基酸进行校准，先测试19种PTH氨基酸的混合标准品，校准测试混合标准品图谱见图2。 图2 PTH-氨基酸混合标准品校准测试图谱 2.2曲妥珠单抗N-末端氨基酸序列分析色谱图 图3-图4分别是曲妥珠单抗重链N-末端氨基酸分析的原始色谱图和差减色谱图，由图所示，重链N-末端第一个循环是 Glu， 第二个循环是 Val，以此类推，前15个循环氨基酸按顺序依不是 Glu-Val-Gln-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly， 与理论氨基酸序列一致。图5-图6分别是曲妥珠单抗轻链N-末端氨基酸分析的原始色谱图和差减色谱图。由图5和图6所示，轻链N-末端第一个循环是 Asp， 第二个循环是Ile，以此类推，前15个循环氨基酸按顺序依次是 Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val， 与理论氨基酸序列相符合。 min min Herceptin heavy chain D07.lcd Herceptin heavy chain D08.lcd mAU mAU 0 10 20 0 10 20 min min 图3|曲妥珠单抗重链N-末端氨基酸序列分析色谱图 图44曲妥珠单抗重链N-末端氨基酸序列分析差减色谱图 mAU mAU Herceptin light chain D04. lcd mAU min Herceptin light chain D05. lcd mAU min min mAU mAU Herceptin light chain D10.lcd min Herceptin light chain D11.lcd Herceptin light chain D12.lcd mAU min 图55曲妥珠单抗轻链N-末端氨基酸序列分析色谱图 mALJ 图6曲妥珠单抗轻链N-末端氨基酸序列分析差减色谱图 结论 本文应用 PPSQ-53A 成功分析了抗体药物曲妥珠单抗(赫赛汀)的重链和轻链的 N- 末端前15个氨基酸序列，结果与理论一致，表明使用 PPSQ可以测测蛋白质的N-末端序列，是生物技术药物研发和质控管理中具有重要作用的分析手段。 ( 岛津全球应用技术开发支持中心 ) min min 本文使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）将曲妥珠单抗的重链和轻链进行分离后，通过电转印方法将凝胶上的样品转移到PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）上，应用蛋白质测序仪PPSQ-53A分别测定重链和轻链的N-末端氨基酸序列，结果与理论序列一致，验证了此方法的准确性。