Exendin-4中甲硫氨酸氧化修饰检测方案(生物质谱)

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LAAN-A-TM055 Applicationn NNo.B78News 用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行行：2018年3月400-650-0439 ApplicationNews MALDI-TOF质量分析法 No.IB78 使用台式MALDI-TOF 质谱MALDI-8020 的源内裂解 (ISD)检测甲硫氨酸氧化修饰 MALDI-TOF MS 是获得肽或蛋白质分子量及一级结构相关信息的一种迅速而又简便的方法。在各种裂解方法中，源内裂解(ISD)可以用于“自上而下”蛋白质组学，得到蛋白质序列。它可以利用氢自由基迁移生成c-及z-碎片离子系列。与源后裂解(PSD) 相比， ISD 的一大优势在于理论上不受样品质量的限制，无需进行酶消化，可以直接对较大的蛋白质进行测序。MALDI-ISD 工作流程的概要如图1所示。 在制药行业的药品开发过程中，为了对失活、毒性等对治疗带来影响的可能性进行监控，作为质量管理(QC)过程的一个组成部分，对制剂配方或降解等导致的变化进行跟踪是非常重要的。其中，肽或蛋白质的甲硫氨酸残基氧化就是一个伴随降解出现修饰的例子。甲硫氨酸同其他氨基酸相比，非常容易氧化。 在这里我们为您介绍通过使用台式 MALDI-TOF 质谱MALDI-8020 进行精确的完整分子量分析和自上而下的序列解析，确定 Exendin-4肽的甲硫氨酸氧化(Met-O)修饰的实例。可以说，在生物药品的QC 中，这种方法对确定不希望在生产 工艺中出现的变化来说是一种有效的方法。 S. Salivo， (Y.Yamazaki) |样品和方法 Exendin-4 肽购自Sigma-Aldrich。甲硫氨酸的氧化按照以下方法进行： Exendin-4与1%过氧化氢(Hz02，pH中性)在37℃条件下孵育15分钟。对样品溶液进行酸化处理，使用ZipTipQ C18(Millipore公司生产)对肽进行纯化。 将天然肽及 Met-O肽与α-氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA，5 mg/mL， 50%乙腈/0.1%三氟乙酸)混合，取1 uL滴在靶板上并干燥。为了进行 ISD分析，将天然肽及氧化型肽与1，5-二氨基萘(1，5-DAN，溶解于50%乙腈/0.1%三氟乙酸中的饱和溶液)混合，取1 uL滴在靶板上并干燥。 使用台式MALDI-TOFMS 中的MALDI-8020，按照图1中所述的测定条件进行分析。 图1MALDI-ISD 的工作流程及质谱采集参数 |结果 Exendin-4 是存在于吉拉毒蜥(Heloderma suspectum)唾液中的天然肽。它的合成形式-Exenatide，用于治疗2型糖尿病。 天然 Exendin-4的 MALDI-ISD 谱图如图2a)所示。图中质量标签与检测到的单同位素峰相对应。 从图2b)的摄像机图像中可以看出，通过优化的样品制备方法而得到的样品具有非常良好的均一性。在质谱的放大区域(图2c)及d))中，显示出碎片离子(m/z 1200-2800范围)单同位素峰的良好分辨率。 a) S： Ce CoCu Cuz Cj3 -18C1： C24 b) cc 2782.：14{r7209.89} M 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 2810 m/z mm■ 为了进行 Mascot-ISD 数据库检索，创建了添加 Exendin-4序列的定制版 Swiss-Prot 数据库，然后，使用MALDI Solutions软件的检索工具进行了 Mascot-ISD 检索。结果如图3所示，得到了有效的得分(图3a))和序列覆盖率(72%；图3b))。 完成氧化反应后，对样品进行了肽分子量的测定，确认成功发生了氧化反应。在使用 CHCA 基质得到的图4的谱图中，天然型(红线)及氧及型(蓝线) Exendin-4 的质谱表现出非常良好的质谱精度和分辨率。正如预测所示，在 Exendin-4中有一处甲硫氨酸支链被氧化，检测到了与生成的亚砜形式相对应的+16Da 的质量迁移。 b) 图3a) MALDI-ISD 的 Mascot检索结果； b) Mascot碎片离子匹配图 + 16 Da 图4天然型 Exendin-4(红线)及Met-O(蓝线) Exendin-4的一级质谱图(基质： CHCA) 氧化型 Exendin-4 的 MALDI-ISD 谱图如图5a))月所示。通过ISD 检测到了在N末端生成的c-离子系列 (c9-c13)及16Da 迁移的c-离子 (c14-c29)。c14离子(用绿色显示)是与含甲硫氨酸残基的氧化部位相对应的碎片离子。 在图5b)中对天然(红线)和氧化型(蓝线) Exendin-4的碎片离子 (m/z 1400-1650)进行了比较。这里显示的碎片离子信号也表现出良好的同位素分离。 正如所期待的那样， c14离子 (HGEGTFTSDLSKQM)显示了与甲硫氨酸的氧化相对应的16 Da 的质量迁移。Exendin-4(Met-O) ISD 图谱的 Mascot 检索采用了先前创建的定制数据库，并指定甲硫氨酸氧化为固定修饰，其结果如图5c)所示，获得了有效的 Mascot 得分。 C。， C10 C11 C12C13C1415 C16C17C18C19Cz20CC21 C23C24425C26 Cz b)HGEGTFTSDLSKQ c) c一 图5 a) Exendin-4 (Met-O) 的 MALDI-ISD 谱图； b)因甲硫氨酸氧化显示出质量迁移的碎片离子(c14)的局部放大图；c) Exendin-4 (Met-O) 的 Mascot-ISD 得分 ZipTip 是 Merck KgaA 的注册商标。 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ( http：//www.shimadzu.com.cn ) *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 使用台式MALDI-TOF质谱MALDI-8020，通过进行精确的完整分子量分析和自上而下的序列解析，确定了Exendin-4肽的甲硫氨酸氧化（Met-O）修饰的位置。这种方法在生物相关药品的质控中，对确定不希望在生产工艺中出现的变化来说是一种有效的方法。