原料药与制剂中亚硝胺类基因毒性杂质检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要] 应用优势 使用沃特世质谱系统标配的ESCi多功能电离源，一针进样，可以采集到ESI、"APCI"两种电离模式的数据，分析效率大大提高。 ACQUITY UPLCI-Class超高效液相色谱显著缩短运行时间，提高样品通量，同时减少溶剂用量。 沃特世质谱系统的自动切换阀可将高含量的主成分切至废液，有效降低质谱系统的污染。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLCI-Class系统 ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl色谱柱 Xevo TQ-S micro Masslynx软件 关键词 简介 亚硝胺类化合物是一类具有R，R，N-N=O基本结构的化合物，具有强致癌性，遗传毒性研究发现，亚硝胺可通过机体代谢或直接作用，诱发基因突变、染色体异常和DNA修复障碍。目前FDA官网已公布了包括缬沙坦胶囊在内几种沙坦类抗高血压药物中三种必检基因毒性杂质的限量标准，标NDMA、NDEA、NMBA相对含量的限量标准分别为0.3、0.083、0.3 ppm。 本文使用沃特世串联四极杆系统标配的ESCi多功能源建立一种检测NDMA、NMBA、NDEA 及NEIPA、NDIPA5种亚硝胺类潜在基因毒性杂质的快速分析方法，并对缬沙坦胶囊、吲达帕胺原料药该5种化合物进行了含量测定，总分析时间6 min。 亚硝胺、基因毒性杂质、缬沙坦、吲达帕胺、ESCi多功能源 实验 流动相B： 有机相，甲醇 柱温： 40°C 进样体积： 10 pL 洗脱梯度： Time Flow Rate (mL/min) A(%) B(%) Curve Initial 0.4 85 15 0.2 0.4 85 15 6 2.5 0.4 60 40 6 4.0 0.4 10 90 6 5.0 0.4 10 90 6 6.0 0.4 85 15 1 质谱系统： Xevo TQ-S micro 电压： 0.5kV(ESI+)， 0.5 uA(模拟APCI+， 下文标记为"APCI"+) 脱溶剂气温度： 600°C 脱溶剂气流速： 1000 L/h 数据采集方式： MRM 切换阀设置： 0~3.5min， to MS， 3.5~6min， to waste 离子对信息： 化合物 母离子 子离子 锥孔电压 碎裂能 检测模式 NEIPA 117 43 24 15 ESI+ 75* 24 8 131 43* 20 10 ESI+ NDIPA 89 20 8 NMBA 147 87 10 10 ESI+ 117* 10 5 NDMA 75 58 20 10 "APCI"+ NDEA 103 47* 15 10 "APCI"+ 75 15 5 注：*表示定量离子；表格中信息，仅供参考。 实验结果与讨论 色谱方法的建立与优化 待检杂质与主成分的有效分离 不论是制剂，还是原料药，基因毒性杂质相对于主成分的含量往往较低，故色谱分离的重点是将杂质与主成分进行有效分离，然后将高含量的主成分切至废液，以保证系统的稳定性，并有效降低维护频率。 图2为化合物缬沙坦、吲达帕胺与5种基因毒性杂质的分离情况。由图2可以看出，该分离条件下，该5种基因毒性杂质与这两种药物皆能有效分离。所以，可以使用相同的色谱分离条件，测定该两种药物中的这5种亚硝胺化合物：使用沃特世质谱仪器内置的阀切换系统，在MRM采集方法中设置0~3.5 min， 进质谱普测，3.5~6 min， 排至废液，有效降低制剂或原料药中超高含量的药物主体化合物对质谱锥孔的污染。 如果样品为不同的药物主成分化合物，则需要考察主成分化合物与要检测的杂质化合物能否有效分离。如果不能有效分离，则需要重新优化色谱分离条件，以保证所建方法的有效性和长期稳定性。 图2.药物主成分缬沙坦、吲达帕胺与5种基因毒性杂质的分离色谱图。 NDMA、NDEA与其他3种亚硝胺化合物的有效分离 该5种亚硝肖化合物中， NDMA、NDEA相对极性较弱，其APCI电离模式的灵敏度优于ESI电离模式，而对于NMBA，使用ESI电离模式的灵敏度远远高于APCI，其他两种化合物(NDIPA、NEIPA)的ESI响应也优于APCI， 所以，本应用使用沃特世质谱系统标配的ESCi多功能电离源，对NDMA、NDEA采用模拟APCI(即"APCI")模式，而其他三种化合物，则采用ESI电离模式，一针进样，完成对5种亚硝胺化合物的定量分析。 为确保NDMA、NDEA的检测灵敏度，在优化色谱方法的时候，尽量让NDMA、NDEA与其他三种化合物区分开，以减小由于电离模式转换带来的灵敏度损失。由上面图2可以看出，本应用优化的色谱方法，基本实现了NDMA、NDEA与其他三种亚硝胺化合物的有效分离，既可以在同一个方法中分析不同电离方式的化合物，又可以使其不受电离模式切换的影响。 API或者制剂样品处理与溶解度问题 根据目前所建分析方法的定量检测限(上机浓度：0.2ng/mL)， 要达到FDA对该类杂质相对含量的最低限量要求(NDEA的限量要求最低，0.083 ppm)，样品的浓度需要在2.4 mg/mL以上。 本文以缬沙坦胶囊及原料药吲达帕胺为测试样品，对前处理方法进行了初步的探索与优化，最终确定先用纯甲醇溶解样品到50 mg/mL，确保样品中甲醇可溶组分充分溶解，再用水稀释到5 mg/mL，涡旋1min，超声15 min， 12000 rpm/min超速离心5分钟，取上清液进样分析。 方法专属性考察 以10%甲醇水、1ng/mL5种亚硝胺的混标溶液、5mg/mL缬沙坦样品溶液、5mg/mL缬沙坦样品添加1ng/mL混标液等4种溶液，来考察所建UPLC-MRM方法的的属属性。图3是该四种样品溶液获得的定量离子对的色谱图。 由图3a、3b可以看出，空白溶剂中，该5种亚硝胺皆无明显信号响应，方法具有良好的选择性；由图3c、3d可知，缬沙坦样品中只检出NDMA，信号强度与1ng/mL信号相当，可知，缬沙坦胶囊样品中NDMA的相对含量约为0.2ppm，低于目前法规的限量要求。 图3.五种亚硝胺化合物定量离子对的提取离子色谱图。 基本方法学验证方法的灵敏度 5种亚硝胺化合物的最低定量限为0.2 ng/mL，图4为相应定量离子对色谱图及其信噪比。 图4.5种亚硝胺混标溶液(0.2 ng/mL)定量离子对色谱图及其信噪比。 工作曲线与重现性 5种亚硝胺类化合物的工作曲线与数据重现性结果见表1，线性范围0.2~100 ng/mL，线性范围内5种亚硝胺的相关系数R?均大于0.999，分别选取两个浓度点LLOQ(0.2ng/mL)、5XLLOQ(1ng/mL)连续6针进样，考察稳定性， LLOQ的RSD%<10%， 5XLLOQ的RSD%<5%，满足分析方法的一般要求。 表1.5种亚硝胺的工作曲线与数据重现性结果汇总表。 杂质名称 工作曲线线性 数据重现性(n=6， RSD%) 线性范围 相关系数 LLOQ 5XLLOQ (ng/mL) R2 (0.2ng/mL) [1ng/mL) NEIPA 0.2~100 0.999 1.56 3.49 NDIPA 0.2~100 0.999 4.42 4.16 NMBA 0.2~100 0.999 3.5 1.72 NDMA 0.2~100 0.999 5.0 3.74 NDEA 0.2~100 0.999 8.63 3.65 实际样品分析与加标回收率试验 本应用测试了两个样品体系，一个是制剂样品，以缬沙坦胶囊为测试样品，一个是原料药，以吲哒帕胺为实际样品。下面是两种样品亚硝胺含量测定和加标回收率结果。 缬沙坦胶囊样品含量测定 按上文样品提取方法，制备缬沙坦胶囊样品测试溶液(5mg/mL)，LC-MRM方法进行含量测定；在样品溶液中添加1ng/mL混标溶液，进行加标回收实验。平行分析两次的测定结果见表2。 由表2可以看出，该5种亚硝胺中，只检测到NDMA，上机浓度约为1ng/mL，相对含量为0.2 ppm， 低于FDA对NDMA的限量要求(0.3ppm)；另外4种亚硝胺皆为阴性。通过加标回收率实验，回收率皆在80~120%之间，进一步确定测定结果准确可靠。 表2.缬沙坦胶囊样品含量测定与加标回收率。 化合物 胶囊样品测试1 胶囊样品测试2 胶囊中含量(ng/mL) 加标 回收率 胶囊中含量 加标1ng/mL后检测浓度 回收率 1ng/mL后检测浓度 (ng/mL) (%) NEIPA ND 0.885 88.5% ND 0.99 99% NDIPA ND 0.82 82% ND 0.935 93.5% NMBA ND 0.865 86.5% ND 0.915 91.5% NDMA 1.06 1.94 88% 0.97 2.06 109% NDEA ND 0.875 87.5% ND 0.895 89.5% 吲达帕胺原料药样品含量测定 按上文样品提取方法，制备吲哒帕胺原料药样品测试溶液(5mg/mL)，LC-MRM方法进行含量测定；并在样品溶液中添加1ng/mL混标溶液，进行加标回收实验。平行分析两次的测定结果见表3. 由表3可以看出，该5种亚硝胺皆为阴性。通过加标回收率实验，回收率皆在80~120%之间，进一步确定测定结果准确可靠。 表3.吲达帕胺原料药样品含量测定与加标回收率。 化合物 原料药样品测试1 原料药样品测试2 加标 原料药中含量 (ng/mL) 加标 回收率 原料中含量 (ng/mL) 1ng/mL 后检测浓度 回收率(%) 1ng/mL 后检测浓度 (%) NEIPA ND 1.055 105.5% ND 1.040 104.0% NDIPA ND 0.966 96.6% ND 0.963 96.3% NMBA ND 1.018 101.8% ND 1.004 100.4% NDMA ND 1.051 105.1% ND 1.068 106.8% NDEA ND 1.064 106.4% ND 1.063 106.3% 实验结论 本文使用沃特世串联四极杆质谱系统标配的ESCi多功能源建立了5种亚硝胺类基因毒性杂质的UPLC-MRM分析方法，针对不同化合物在不同电离模式下灵敏度不同的特点，在一个方法中，通过ESI与"APCI"电离模式的切换，取长补短，达成该5种亚硝胺化合物的同时分析，并确保不同化合物皆有较好的灵敏度。0.2 ng/mL(LOQ)与1ng/mL分别连续6针进样，数据稳定性良好。 需要注意两点： 色谱方法需要针对不同的药物主体进行优化，或重新建立，实现杂质与主成分充分分离，以将高含量的药物主体切至废液，减少其对质谱的污染； 针对药物主体化合物的溶解度、样品的不同类型(制剂/原料药)，样品中杂质化合物的提取方式有时也需要适当的调整与优化，确保分析方法达到分析检测的实际要求。 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 820 2676www.waters.com ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro快速分析原料药与制剂中多种亚硝胺类基因毒性杂质 应用优势1）使用沃特世质谱系统标配的ESCi多功能电离源，一针进样，可以采集到 ESI、"APCI”两种电离模式的数据，分析效率大大提高。 2）ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱显著缩短运行时间，提高样品通量，同时减少溶剂用量。3）沃特世质谱系统的自动切换阀可将高含量的主成分切至废液，有效降低质谱系统的污染。简介 亚硝胺类化合物是一类具有R1R2N-N＝O基本结构的化合物，具有强致癌性，遗传毒性研究发现，亚硝胺可通过机体代谢或直接作用，诱发基因突变、染色体异常和DNA修复障碍。目前FDA官网已公布了包括缬沙坦胶囊在内几种沙坦类抗高血压药物中三种必检基因毒性杂质的限量标准，即NDMA、NDEA、NMBA相对含量的限量标准分别为0.3、0.083、0.3 ppm。本文使用沃特世串联四极杆系统标配的ESCi多功能源建立一种检测NDMA、 NMBA、NDEA 及NEIPA、NDIPA5种亚硝胺类潜在基因毒性杂质的快速分析方法，并对缬沙坦胶囊、吲达帕胺原料药该5种化合物进行了含量测定，总分析时间6min。实验结论 1）本文使用沃特世串联四极杆质谱系统标配的ESCi多功能源建立了5种亚硝胺类基因毒性杂质的UPLC-MRM分析方法，针对不同化合物在不同电离模式下灵敏度不同的特点，在一个方法中，通过ESI 与“APCI”电离模式的切换，取长补短，达成该5种亚硝胺化合物的同时分析，并确保不同化合物皆有较好的灵敏度。0.2 ng/mL（LOQ）与1 ng/mL分别连续6针进样，数据稳定性良好。2）需要注意两点：一、色谱方法需要针对不同的药物主体进行优化，或重新建立，实现杂质与主成分充分分离，以将高含量的药物主体切至废液，减少其对质谱的污染； 二、针对药物主体化合物的溶解度、样品的不同类型（制剂/原料药），样品中杂质化合物的提取方式有时也需要适当的调整与优化，确保分析方法达到分析检测的实际要求。