茶叶中形态硒含量检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA19-090Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-112 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline： 021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road， Shanghai HPLC-ICP-MS 法测定茶叶中多种形态硒的含量 CPMS-112 摘要：本文采用蛋白蛋K提取茶叶中的硒化合物，建立了使用岛津高效液相色谱 LC-20Ai 和电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030联用测定茶叶中形态硒含量的方法。该方法线性范围在2.0~100 ug/L 范围内回归系数大于0.9995，加标回收率在88~113.3%之间，重现性<3.0%，方法定量限在 0.034-0.048 mg/kg 之间，适用于茶叶中的形态硒含量分析。 关键词： HPLC-ICP-MS茶叶形态硒 硒是人体必需的微量元素之一。自然界中的硒具有丰富、复杂的化学形态，整体上可分为无机硒和有机硒两大类，无机硒(硒酸硒[Se(ⅥI)]、亚硒酸根[Se(IV)])具有很强的毒性，不能被人体利用；而有机硒(硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCysz)、甲基-硒代-L半胱氨酸(SeMC)等)广泛存在于蛋白质中，参与酶的合成，保护细胞膜，所以有机硒具有保护心脏，抗衰老，预防癌变，细胞修复，提高免疫力等多种用途。 基于硒元素的重要功效，一些富硒食品也陆续被研发出来，用于补充人群对硒的摄入。在食品富硒的过程中通常人为地引入硒添加剂，而以无机形态存在的硒又是毒性较大的。因此，准确地定性和定量茶叶 中的无机硒，对食品安全有着重要的指导意义；另外，不同环境地区中，硒的存在含量及形态也有所差别。了解环境和样品中硒的具体形态，有助于准确评价生物活性、毒性、对环境的生态效应和物品产源地等信息。 目前，在元素形态分析技术中，色谱与质谱的联用已成为主要趋势。本文根据在阴离子交换色谱体系中，不同形态硒的保留时间有所不同的机理，使用岛津高效液相色谱LC-20Ai 和电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030联用建立了分离并角确定量茶叶中多种形态硒的方法。 I实验部分 1.1仪器 亚硒酸根[Se(IV )]、硒酸根[Se(ⅥI)]、硒代胱氨酸 (SeCys2)、硒代蛋氨酸 (SeMet) 和甲基-硒代半胱氨酸 (SeMC)标准物质 1.2样品 茶叶 1.3仪器 本实验使用岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai 与电感耦合等离子体质谱仪 ICPMS-2030联用系统。具体配置为LC-20Ai×2输液泵， DGU-20A3在线脱气机， SIL-20AC自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A系统控制器，ICPMS-2030电感禺合等离子体质谱仪， LabSolutions ICPMS TRM 工作站； AUW220D电子天平(日本岛津公司)。 1.4试剂 实验用水由Milli-Q水净化系统经去离子与二次净化制得；蛋白酶K (Merk公司)；柠檬酸(天津大茂) I方法 2.1标准溶液配制 以硒的单形态溶液标准物质为对照品，使用纯水配制浓度分别为0.0、2.0、10.0、25.0、50.0及100.0 ug/L 的亚硒酸根 [Se(IV )]、硒酸根 [Se(ⅥI)]、硒代胱氨酸(SeCys2)系列混合标准溶液。 2.2样品的处理方法 准确称0.2g茶叶样品置于10 mL离心管中，加入1mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液，加入超纯水定容至10mL， 将离心管放置到超声仪中超声1h，取出离心管放置到离心机中，以10000 r/min的转速离心15 min， 取上清液经0.22 um 的滤膜过滤后上机测定。 2.3色谱条件 色谱条件参见表1 表1HPLC分析条件 参数 参数设定 色谱柱 Hamilton PRP-X100 (250*4.1mm； 10 um) 流动相 流动相A： 10mM柠檬酸溶液(pH5.5)；流动相B：超纯水 流速 1.0 mL/min 柱温 30℃ 进样量 50uL 表2梯度洗脱条件 Time Flow A.Conc B.Conc 0.0 1.0 14.0 86.0 6.5 1.0 14.0 86.0 7.0 1.0 80.0 20.0 13.5 1.0 80.0 20.0 14.0 1.0 14.0 86.0 16.0 1.0 14.0 86.0 2.4质谱条件 ICP-MS仪器分析条件见表3 表3ICP-MS分析条件 参数 参数设定 参数 参数设定 高频功率 1.20 kW 等离子体气流速 8.0 L/min 辅助气流速 1.10 L/min 载气流速 0.70 L/min 炬管类型 Mini炬管 雾化器 同心雾化器 雾化室 旋流 雾化室温度 5°℃ 采样深度 5.0 mm 高频频率 27.12 MHz 碰撞气体 He 碰撞气流速 6 mL/min 池电压 -21V 能量过滤器电压 7.0V |结果与讨论 3.1专属性考察 对空白和亚硒酸根 [Se(IV)]、硒酸根 [Se(ⅥI )]、硒代胱氨酸 (SeCysz)、硒代蛋氨酸(SeMet)和甲基-硒代半胱氨酸(SeMC)混合标准溶液及单形态标准溶液进样考察，考察各个形态硒之间的分离度以及保留时间，以确保实际样品分析过程中不会造成形态之间的干扰，见图1。 图1形态硒的色谱图 3.2线性关系考察 按“2.1标准溶液的配制”项下规定进行标准曲线系列浓度的配制，测试各浓度点不同形态硒色谱峰的面积，以浓度与峰面积比值做线性回归绘制标准曲线，结果见图2所示。 图2Se(ⅣV)校准曲线r=0.99976Conc.=0.0810530*|+0.9324 图3Se(ⅥI)校准曲线 r=0.99998Conc.=0.0809386*|+0.3755 3.3检出限考察 在进样体积为50 uL时，对浓度为2.0 ug/L样品溶液考察亚硒酸根[Se( IV )]、硒酸根 [Se(VI)]、硒代胱氨酸 (SeCys2)的信噪比，折算信噪比 S/N=3时为仪器检出限，并依据样品前处理过程计算方法检出限，结果如下： 图42.0ug/L形态硒标准溶液的色谱图 表2梯度洗脱条件 名称 仪器检出限(pg/L) 方法去出限(mg/kg) 定量下限(mg/kg) Se(IV) 0.21 0.011 0.034 Se(ⅥI) 0.23 0.012 0.038 SeCys2 0.29 0.015 0.048 3.4样品分析结果 使用 HPLC分离亚硒酸根 [Se(ⅣV)]、硒酸根[Se(ⅥI)]、硒代胱氨酸 (SeCysz)， ICPMS-2030测定了茶叶中的几种形态硒，并进行加标回收率实验。同一样品重复进样3针考察测量重复性。实验结果果表5： 表5样品测定及回收率考察结果 名称 测定结果 加标量 加标后测定值 加标回收率 RSD (n=3) (ug/L) (ug/L) (ug/L) (%) (%) Se( ⅣV ) 0.93 10.0 11.6 106.7 0.86 20.0 23.6 113.3 2.48 Se(VI) 0.38 10.0 10.9 105.2 1.89 20.0 22.7 111.6 0.67 SeCys2 1.05 10.0 9.85 88 1.12 20.0 20.8 98.8 0.48 I结论 本文将高灵敏度的 ICPMS-2030与岛津高效液相色谱 LC-20Ai联用，利用阴离子交换色谱分离的机理，建立了 HPLC-ICP-MS快速测定茶叶中形态硒含量的分析方法。分析结果线性相关系数良好， r>0.9995，加标回收率良好，方法准确、可靠。且具操作简单、快速高效、精密度高和环境友好的特点，适用于茶叶中形态硒的定性和定量分析。  硒是人体必需的微量元素之一。自然界中的硒可分为无机硒和有机硒两大类，无机硒（硒酸根[Se(Ⅵ)]、亚硒酸根[Se(Ⅳ)]）具有很强的毒性，不能被人体利用；而有机硒广泛存在于蛋白质中，参与酶的合成，保护细胞膜，具有保护心脏，抗衰老，预防癌变，细胞修复，提高免疫力等多种用途。准确地定性和定量茶叶中的硒形态，不但对食品安全有着重要的指导意义，还能有助于准确评价生物活性、毒性、对环境的生态效应和物品产源地等信息。       目前，在硒元素形态分析技术中，色谱与质谱的联用已成为主要趋势。本文使用岛津高效液相色谱LC-20Ai和电感耦合等离子体质谱ICPMS-2030联用建立了分离并准确定量茶叶中多种形态硒的方法。方法线性范围在2.0~100 µg/L范围内回归系数大于0.9995，加标回收率在88~113.3%之间，重现性<3.0%，方法定量限在0.034-0.048 mg/kg之间，适用于茶叶中的形态硒含量分析。。