血清中7种类固醇激素的临床研究检测方案(二手分析仪器)

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「应用纪要WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. |应用纪要 分析血清中7种类固醇激素的临床研究 Dominic Foley和Lisa Calton 应用优势 色谱方法具有出色的分析选择性，可以分离同分异构体 利用多孔板配置实现高通量的LC-MS/MS分析 睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇的分析结果与EQA质谱法平均值具有良好的一致性 沃特世解决方案Oasis" PRiME HLB uElution板 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuardM保护柱 ACQUITY UPLCI-Class系统(FTN) Xevo"TQ-S micro MassLynx"软件 TargetLynx"应用管理软件 MassLynx LIMS Interface v3.0 Tecan文件转换器v2.0 关键词 睾酮，雄烯二酮，17-OHP， DHEAS，皮质醇，11-脱氧皮质醇，21-脱氧皮质醇， SPE，LC-MS/MS， Xevo TQ-S micro，自动化 简介 类固醇激素是一大类小分子，在代谢过程中发挥着非常重要的作用，例如性别特征调节、血压调节和炎症反应调节等。参与类固醇生物合成的某些酶类在这些代谢过程中非常关键。通过测定合成途径中的类固醇激素，，可以监测这些酶是否出现功能异常。若使用免疫分析法测定这些类固醇激素，由于抗体试剂会与结构相似的类固醇激素以及合成途径的衍生物发生交叉反应，因此分析极易受到干扰。而使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定这些类固醇激素可以获得极高的灵敏度、准确度和精密度。 本应用纪要介绍了一种分析睾酮、雄烯二酮、17-羟基孕酮(17-OHP)、脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇的临床研究方法，该方法使用Oasis PRiME HLB pElution板从血清中富集纯化目标分析物(工作流程已采用Tecan Freedom EVO 100/4液体处理器实现了自动化)，然后使用配备ACQUITY UPLC HSS T3 VanGuard保护柱和ACQUITY UPLC HSST3色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，最后在Xevo TQ-Smicro质谱仪(图1)上进行检测。此外，本研究还通过分析睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇的室间质量评估(EQA)样品评估了该方法的偏差，以此判断该方法是否适合在临床研究中用于类固醇分析。 实验 LC条件 系统： ACQUITY UPLCI-Class (FTN)进样针：30 pL色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T32.1x 50 mm， 1.8 pm(部件号186003538)保护柱：ACQUITY UPLC HSST3 VanGuard2.1x5 mm， 1.8 pm(部件号186003976)流动相A：水+2mM醋酸铵+0.1%甲酸流动相B：甲醇+2mM醋酸铵+0.1%甲酸洗针液：甲醇灌注溶剂：40%甲醇(水溶液)柱温：50°C进样体积：20 pL流速：0.60 mL/min梯度：见表1运行时间：4.7 minMS条件系统：Xevo TQ-S micro分辨率：MS1(0.75FWHM)MS2 (0.5 FWHM)采集模式：多反应监测(MRM)(详见表2)极性：ESI +/-毛细管电压：1.0 kV离子源温度：150°C脱溶剂气温度：600°C 扫描间延迟时间： 0.01 s 通道间延迟时间： 0.02s 数据管理 带TargetLynx应用管理软件的 睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇认证参比溶液，以及睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇和11-脱氧皮质醇的稳定同位素内标购自Sigma Aldrich(英国普尔)。21-脱氧皮质醇的稳定同位素内标购自Isosciences(宾夕法尼亚州普鲁士王国)。 使用购自Golden West Biologicals(加利福尼亚州特曼库拉)的替代基质 MSG4000(经处理的人血清)制备校准品和质量控制样品(QC)。制备浓度范围 为0.10~69 nmol/L的睾酮校准品，以及浓度为0.35 nmol/L、3.5 nmol/L和49 nmol/L的QC样品。制备浓度范围为0.09~349 nmol/L的雄烯二酮校准品，以 及浓度为0.52 nmol/L、17.5nmol/L和245nmol/L的QC样品。制备浓度范围为 0.19~757 nmol/L的17-OHP校准品，以及浓度为0.76 nmol/L、38nmol/L和 530 nmol/L的QC样品。制备浓度范围为0.065~43 pmol/L的DHEAS校准品， 以及浓度为0.41 pmol/L、2.2 pmol/L和30 pmol/L的QC样品。制备浓度范围为 0.69~1380 nmol/L的皮质醇校准品，以及浓度为0.83 nmol/L、69 nmol/L和 966 nmol/L的QC样品。制备浓度范围为0.72~144 nmol/L的11-脱氧皮质醇和 21-脱氧皮质醇校准品。11-脱氧皮质醇的QC样品浓度为1.44 nmol/L、 7.2 nmol/L和101 nmol/L。21-脱氧皮质醇的质量控制样品浓度为2.2 nmol/L、7.2 nmol/L和101 nmol/L。 睾酮数据除以3.470(nmol/L转换为ng/mL)、雄烯二酮数据除以3.494(nmol/L转换为ng/mL)、17-OHP数据除以3.028(nmol/L转换为ng/mL)、DHEAS数据除以2.716(nmol/L转换为ng/mL)、皮质醇数据除以2.761(nmol/L转换为ng/mL)、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇数据除以2.889(nmol/L转换为ng/mL)可以将SI单位转换为传统的质量单位。 样品萃取 使用液体处理器萃取样品。向100 pL样品中添加25 pL 28 nmol/L的睾酮-13C，和雄烯二酮-13C、75nmol/L的17-OHP-13C 、1.4 pmol/L的DHEAS-2H 、137nmol/L的皮质醇-13C，、71nmol/L的11-脱氧皮质醇-13C，和21-脱氧皮质醇-2H，并添加200pL甲醇和550pL水。每次添加试剂之后充分混合样品。将样品在4000 g下离心5 min， 从每每预处理样品中取600uL上清上样至Oasis PRiME HLB uElution板的孔中，并在低真空下(100 mbar)使样品缓慢通过板孔。接下来，分别使用150pL0.1%(v/v)氨水的35%(v/v)甲醇溶液(水溶液)、150 uL 0.1%(v/v)甲酸的35%(v/v)甲醇溶液(水溶液)进行清洗，以减少潜在的离子干扰。然后，使用30 pL85/15(v/v)乙腈/甲醇洗脱分析物，接着加入70pL水。 方法条件 时间 流速 (mL/min) %A %B 曲线 (min) 初始 0.600 55 45 初始 1.0 0.600 55 45 6 3.5 0.600 35 65 6 3.51 0.600 2 98 11 4.0 0.600 55 45 11 表1.用于分离类固醇激素的梯度表。初始条件下的操作背压约为8500 psi。 分析物 ESI 模式 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能量 (m/z) (m/z) (V) (eV) 睾酮(定量离子) + 289.2 97.0 45 20 睾酮(定性离子) + 289.2 109.0 45 20 睾酮-1C， + 292.2 100.0 45 20 雄烯二酮(定量离子) + 287.2 97.0 45 20 雄烯二酮(定性离子) + 287.2 109.0 45 20 雄烯二酮13C， + 290.2 100.0 45 20 17-OHP(定量离子) + 331.2 97.0 55 24 17-OHP(定性离子) + 331.2 109.0 55 24 17-OHP-13C. + 331.2 100.0 55 24 DHEAS - 367.2 97.0 45 30 DHEAS-2H_ 372.2 98.0 45 30 皮质醇(定量离子) + 363.2 97.0 45 24 皮质醇(定性离子) 十 363.2 121.0 45 24 皮质醇-13C， + 366.2 124.0 45 24 11-脱氧皮质醇(定量离子) + 347.2 97.0 45 24 11-脱氧皮质醇(定性离子)* + 347.2 121.0 45 24 11-脱氧皮质醇-13C， + 350.2 100.0 45 24 21-氧氧皮质醇 + 347.2 175.1 45 30 21-脱氧皮质醇-2H + 351.2 177.1 45 30 表2.睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇及其稳定同位素标记内标的MRM参数。 DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇的扫描窗口为1.4-2.8 min (+/-切换)，睾酮、雄烯二酮和17-OHP的扫描窗口为2.61-3.8 min。其它所有时间内流动相导入废液。驻留时间设为自动，6s采集15个峰数据点。**同时用作21-脱氧皮质醇的定性通道。 类固醇激素的同分异构体(11-脱氧皮质醇、皮质酉和21-脱氧皮质醇； 17-OHP和21-OHP；睾酮和表睾酮)实现了基线分离，证明色谱柱具有良好的色谱选择性(图2)。本研究单独分析了睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇与其它10种结构相似化合物(21-羟基孕酮、皮质酮、DHEA、表睾酮、二氢睾酮、醛固酮、可的松、18-羟基皮质酮、17-羟基孕烯醇酮和强的松)，在这些分析物的保留时间处未观察到干扰。 我们注意到，在泼尼松龙浓度较高(>0.5 pmol/L)的情况下，低浓度(20 nmol/L)皮质醇的结果偏差大于20%。 这是因为泼尼松龙会对皮质醇的MRM谱图造成同位素影响。 通过定量离子和定性离子的离子丰度比变化可以检测到这种干扰。分析其他内源性化合物(白蛋白、胆红素、尿酸、脂肪乳剂、甘油三酸酯和胆固醇)时，未见睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇受到显著干扰(偏差≤10%)。 分析高浓度样品之后，未在后续的空白进样中观察到系统残留污染。 通过1：5稀释成功测定了高浓度样品，睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇的平均准确度分别为102%、98%、99%、96%、94%、107%和97%， RSD<7%。 该方法对0.10 nmol/L的睾酮、0.09 nmol/L的雄烯二酮、0.19 nmol/L的17-OHP、0.65 pumol/L的DHEAS、0.69nmol/L的皮质醇以及0.72 nmol/L的11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇可以进行精确定量(RSD<20%)。将以上浓度的分析物加入到去除激素的血清基质中，分别进行10次独立试验测定，信噪比均>10：1。 我们在五天内每天对三个浓度的QC样品进行两次萃取和定量分析(每个浓度三个重复样， n=30)，以此确定该方法的批间精密度。通过分析各QC水平的三个重复样评估方法的重现性。低、中、高QC样品的浓度分别为：睾酮-0.35 nmol/L、3.5 nmol/L、49nmol/L；雄烯二酮-0.52 nmol/L、17.5 nmol/L、245 nmol/L； 17-OHP-0.76 nmol/L、38 nmol/L、530 nmol/L； DHEAS-0.41pmol/L、2.2 umol/L、30 pmol/L；皮质醇-0.83 nmol/L、69 nmol/L、966 nmol/L；11-脱氧皮质醇-1.44 nmol/L、7.2 nmol/L、101 nmol/L； 21-脱氧皮质醇-2.2 nmol/L、7.2 nmol/L、101 nmol/L。如表3所示，类固醇激素的QC批间精密度和重现性≤7.6% QC的批间精密度 QC重现性 化合物 低 中 高 低 中 高 睾酮 5.6% 6.0% 6.3% 3.2% 2.7% 3.2% 雄烯二酮 6.0% 5.2% 4.8% 4.0% 2.7% 3.5% 17-OHP 5.1% 5.3% 5.1% 3.4% 2.7% 3.4% DHEAS 5.5% 7.6% 6.0% 3.9% 2.1% 3.4% 皮质醇 7.3% 5.4% 5.1% 7.3% 2.7% 3.5% 11-脱氧皮质醇 5.3% 5.7% 5.5% 3.5% 3.3% 3.5% 21-脱氧皮质醇 6.9% 6.2% 6.6% 4.9% 4.2% 5.2% 表3.睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇分析的批间精密度和重现性。 将待测分析物按不同比例混合，再配制不同的高浓度和低浓度样品做线性，所得样品的分析结果表明，各分析物在如下的浓度范围内呈线性：睾酮0.10~69 nmol/L， 雄烯二酮0.09~349 nmol/L， 17-OHP 0.19~757 nmol/L， DHEAS 0.065~43 pmol/L， 皮质醇0.69~1380 nmol/L， 11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇0.72~144 nmol/L。此外，在所有分析中，加标血清样品的校准曲线均呈线性，且相关系数(r?)>0.994。 使用来自单个供体的血清样品研究睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇的基质效应(n=6)。基质因子计算结果如表4所示。基于分析物：内标响应比率计算归一化的基质因子，结果表明内标可以补偿观察到的所有离子抑制效应。 DHEAS %RSD %RSD 皮质醇 响应比率 11-脱氧皮质醇 0.70(0.63-0.75) 6.2% 1.00(0.97-1.02) 1.8% 1.00(0.97-1.02) 1.8% 0.79 (0.74-0.84) 4.0% 0.79(0.76-0.82) 3.3% 0.99(0.96-1.01) 1.7% 0.94(0.92-0.96) 1.6% 0.99(0.96-1.01) 1.7% 6.7% 0.99(0.87-1.06) 6.6% 4.1% 1.5% 1.00(0.98-1.02) 1.6% 表4.基于分析物峰面积和响应比率计算的平均基质因子(范围)和%RSD。 通过分析EQA样品评估睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇的分析准确度。将所得结果与这些样品的质谱法平均结果进行比较，并进行Deming回归分析、Altman-Bland一致性分析和线性回归分析(表5)。从统计学方面来说，睾酮和皮质酮的数据中未观察到显著的比例偏差或常值偏差；雄烯二酮和17-OHP的数据呈现显著的比例偏差， DHEAS的数据呈现显著的常值偏差。睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇数据的Altman-Bland分致性分析显示，平均方法偏差在±5.8%范围内，表明该方法分析类固醇激素所得的结果与EQA质谱法平均结果相比，具有良好的一致性(图3A-E)。 化合物 样品 Deming 回归方程 平均偏差 线性拟合(r) 睾酮 33 Y=1.00x-0.00 -0.1% 0.998 雄烯二酮 55 Y=0.94x+0.11 -5.1% 0.998 17-OHP 54 Y=1.07x-0.25 5.2% 0.997 DHEAS 45 Y=0.98x-0.45 -5.8% 0.991 皮质醇 55 Y=0.99x+0.25 -1.0% 0.996 表5. Deming回归分析，对比了采用Waters LC-MS/MS方法和EQA方案MS方法分析睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇的结果。 图3. Altman-Bland一致性分析，对比了采用Waters LC-MS/MS方法和EQA方案MS方法分析(a)睾酮、(b)雄烯二酮、(c)17-OHP、(d) DHEAS和(e)皮质醇的结果。 结论 本研究使用Xevo TQ-S micro开发了一种高灵敏度和高选择性分析血清样品中的睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇的分析方法。 Xevo TQ-S micro为该方法提供了足够的分析灵敏度，仅使用100pL样品即可测定低浓度的睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇。该方法在校准范围内表现出良好的精密度。EQA样品的分析结果表明，该方法分析睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS和皮质醇的结果与EQA LC-MS/MS平均值相比，具有良好的一一性。利用Tecan文件转换器和MassLynx LIMS Interface， 可以将方法自动化的优势与液体处理器的样品追踪功能相结合，从而改进实验室工作流程并减少样品处理工作量。 仅供研究使用。不适用于诊断。 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters、 The Science of What's Possible、ACQUITY UPLC、Oasis、Xevo、MassLynx、Vanguard和TargetLynx是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 扫一扫，关注沃特世微信 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 8202676www.waters.com 分析血清中的皮质类固醇激素和雄激素的临床研究 本研究使用Xevo TQ-S micro开发了一种高灵敏度和高选择性分析血清样品中 的睾酮、雄烯二酮、17-OHP、DHEAS、皮质醇、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮 质醇的分析方法