人血浆中27种激素含量检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-130Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-466 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel： 86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8050 CL 测定人血浆中27激激素含量 LCMSMS-466 摘要：本文使用岛津临床超高效液相色谱仪 LC-30A CL与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL 联用建立了人血浆中20种内源性激素及7种外源性激素同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，，可为相关从业人员提供参考。 类固醇激素又称甾体激素，是内分泌细胞分泌的高效能生物化学物质，在维持生命、调节机体物质代谢、促进性器官发育和维持生育等方面起着重要作用，其代谢过程见图1。临床上将类固醇激素水平作为较多疾病的诊断指标，包括先天性类固醇代谢紊乱和获得性类固醇代谢紊乱等，主要涉及到8个Panel，包括肥胖组合、肾上腺皮质功能减退组合、原发性醛固酮增多症组合、库欣综合征组合、肾上腺增生组合、男性性功能减退组合、多囊卵巢综合征组合及地塞米松抑制实验组合，且一种疾病常伴有多种类固醇激素异常，如先天性肾上腺皮质增生症(Congenital adrenalhyperplasia， CAH) 筛查时需要同时检测17-羟孕酮 (17-OH-P)、雄烯二酮(A4)、肾上腺皮质醇(F)、11-脱氧皮质醇(S)和21-脱氧皮质醇(21-DOC)等多种类固醇激素的水平。除此之外，外源性激素，如泼尼松、地塞米松、氟米龙、、I甲基泼尼松龙等在临床上作为抗炎类激素药物应用广泛，但这些药物的长期使用和过度使用会导致内分泌代谢混乱的临床表现，患者可能呈现库欣综合征的临床特征。因此，临床上急需一种同时测定多种内源性激素及外源性激素的方法。 本实验使用岛津临床用液相色谱三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL， 建立了人血浆中27种激素含量测定方法，该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，前处理简单，可为相关从业人员提供参考。 图1 类固醇激素代谢图径(引自梅奥医学官网) 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 CL联用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵)， DGU-20AsR CL (在线脱气机)， SIL-30ACMP CL(自动进样器)， CTO-30ACL(柱温箱)，CBM-20A CL系统控制器， LCMS-8050 CL三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-packVelox SP-C18(50 mm×2.1mml.D.， 1.8um) 预柱： Velox EXP Guard SP-C18 (5 mm×2.1 mm l.D.， 1.8 um) 流动相：A相-0.05mM氟化铵水溶液；B相-甲醇 流速：0.4mL/min 柱温：45℃ 进样量：10 uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为40%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.00 泵 B.Conc 40 4.00 泵 B.Conc 50 6.00 泵 B.Conc 70 7.50 泵 B.Conc 95 8.50 泵 B.Conc 95 8.51 泵 B.Conc 40 10.00 控制器 Stop 质谱条件： 分析仪器：LCMS-8050 CL DL温度：150℃ 离子源：ESI(±)雾化气流速：3.0L/min加热气流速：12.0 L/min 加热模块温度：450℃ 干燥气流速：8.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：400℃ MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 编号 名称 英文简写 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q1 Pre Bias (V) 1 褪黑素 Melatonin 233.1 174.1 -17 -16 -30 2 醛固酮 ALD 361.2 315.15 -29 -19 -22 3 可的松 COR 361.15 163.15 -14 -24 -29 皮质醇 F 363.2 121.15 -14 -25 -23 5 21-脱氧皮质醇 21DOC 347.2 311.2 -13 -16 -21 6 皮质酮 CORT 347.2 121.1 -26 -23 11-脱氧皮质醇 S 347.2 97.1 -14 -19 1.3标准品及样品制备 标准溶液制备：取27种激素混标母液，用甲醇稀释成相应浓度混标中间液，再用纯水稀释成系列浓度的标准工作液。内标溶液使用甲醇配置成内标工作液。取250 uL标准工作液，加入10 uL内标溶液，涡旋混匀，加入250uL甲醇，涡旋混匀，加入250uL水，涡旋混匀。 样品溶液制备：取250uL血浆样本，加入10uL内标溶液，涡旋混匀，加入250 uL甲醇，涡旋混匀，加入250pL水，涡旋混匀后，13000 rpm 高速离心5min。 标准品及样品净化：取标准品溶液及样品上清液600 uL 至HLB型96孔固相萃取板中(固相萃取板使用前经200 uL乙腈及 200 uL甲醇活化，再经200 uL纯化水平衡两次)，下接废液收集板，弃去废液，使用200 uL5%甲醇洗涤固相萃取板2次，弃去废液，再使用200 uL正己烷洗涤固相萃取板1次，弃去废液，将接收板改为全新96孔接收板，使用50 uL乙腈洗脱固相萃取板两次，将收集液氮气吹干，加50 uL初始流动相复溶，振摇混匀后上机测定。 结果讨论 2.1 MRM 色谱图 图2标准品色谱图(1-Melatonin，2-DHEAS， 3-Triamcinolone，4-E3， 5-ALD，6-Prednisolone， 7-COR，8-Fludrocortisone，9-F，10-Prednisolone，11-21DOC，12-Dexamethasone， 13-Methylprednisolone， 14-CORT， 15-Fluorometholone， 16-S， 17-E2， 18-E1，19-A4， 20-DOC， 21-17-OH-PR，22-DHEA， 23-17a-OH-P， 24-T， 25-DHT，26-P，27-Pregnenolone) 图3 类固醇激素典型谱图 2.2线性测定结果 对标准品按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，27种激素在标准曲线浓度范围内线性相关系数均大于0.994，准确度在87.3%~114.1%之间，满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围(ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 Melatonin Y=(24.6346)X+(-0.000927508) 0.0004~4 0.9974 90.5~108.2 2 ALD Y=(2.89603)X+(0.0100745) 0.006~6 0.9973 94.0~106.2 3 COR Y=(0.474865)X+(0.00159505) 0.02~200 0.9969 89.5~112.8 4 F Y=(0.0367086)X+(0.000154501) 0.1~200 0.9971 88.3-108.0 5 21DOC Y=(7.97450)X+(-0.00880704) 0.004~10 0.9953 87.3~113.2 6 CORT Y=(8.84417)X+(0.00369258) 0.006~60 0.9976 89.8~111.8 / S Y=(1.01268)X+(0.00314685) 0.005~10 0.9957 89.0~110.8 8 A4 Y=(0.363220)X+(0.00104317) 0.008-16 0.9987 92.3~109.2 9 DOC Y=(17.0724)X+(0.0342154) 0.005~10 0.9974 92.6~106.3 10 T Y=(1.85069)X+(2.49286e-005) 0.004~20 0.9984 91.6~110.3 11 DHEA Y=(0.219019)X+(0.00341440) 0.12~60 0.9988 93.7~109.0 12 17a-OH-P Y=(1.41590)X+(0.00165019) 0.01~50 0.9990 92.4~105.6 13 DHT Y=(3.37220)X+(0.0582751) 0.008~4 0.9958 91.7~110.3 14 P Y=(0.670008)X+ (0.000460979) 0.003~30 0.9991 93.0~106.9 15 Pregnenolone Y=(1.04419)X+(0.00210575) 0.05~100 0.9987 93.5~108.9 16 DHEAS Y=(0.594097)X+ (0.156454) 2~1000 0.9992 94.3~106.5 17 E3 Y=(4.57957)X+(-0.0281651 0.02~4 0.9950 88.5~112.2 18 E2 Y=(0.434300)X+(0.00141817) 0.02~40 0.9975 92.0~111.2 19 E1 Y=(0.249536)X+(0.00525737) 0.03~30 0.9988 94.2~107.1 20 17-OH-PR Y=(0.723912)X+(0.0715243) 0.1~200 0.9948 89.2~113.3 21 Triamcinolone Y=(0.992006)X+(0.0254733) 0.1~100 0.9965 89.9~113.5 22 Prednisone Y=(1.22615)X+(0.00532629) 0.1~100 0.9969 87.9~105.5 23 Fludrocortisone Y=(2.26075)X+(-0.0277486) 0.1~100 0.9972 87.9~111.9 24 Prednisolone Y=(0.0323217)X+(0.00105096) 0.1~100 0.9963 98.8~114.1 25 Dexamethasone Y=(0.0062866)X+(0.000193387) 0.1~100 0.9950 85.9~114.0 26 Fluorometholone Y=(1.77818)X+(-0.0352560) 0.1~100 0.9992 95.0~105.5 27 Methylprednisolone Y=(0.0298736)X+(0.00111742) 0.1~100 0.9945 87.3~113.0 2.3精密度测定结果 取混合对照品溶液，连续进样6针，考察仪器精密度，具体测定浓度及峰面积精密度见表4，结果显示，27种激素在测定浓度下峰面积精密度在1.1%~8.9%之间， LCMS-8050 CL 测定27种激素精密度良好。 精密度实验结果 名称 测定浓度 RSD% 名称 测定浓度 RSD% Melatonin 0.04 1.1 Pregnenolone 1 2.4 ALD 0.06 4.9 DHEAS 10 1.2 COR 2 1.8 E3 0.04 7.5 F 10 2.4 E2 0.4 7.3 21DOC 0.2 2.8 E1 0.3 8.9 CORT 0.6 1.7 17-OH-PR 2 3.5 S 0.1 3.7 Triamcinolone 3 3.6 A4 0.16 3.0 Prednisone 1 4.0 DOC 0.1 3.0 Fludrocortisone 1 2.9 T 0.2 1.2 Prednisolone 1 1.9 DHEA 0.6 6.1 Dexamethasone 1 1.8 17a-OH-P 0.5 2.1 Fluorometholone 1 1.8 DHT 0.04 8.7 Methylprednisolone 1 3.6 P 0.3 1.3 2.4准确度测定结果 按1.3中的前处理方法对空白血浆添加低高浓度标准品作为低高浓度质控品，按1.2中的分析条件对质控品进行分析，每个样品平行制备3份，质控品的准确度结果如表5所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，均在81.2%~116.6%之间，满足临床测定需求。样品平行制备3份进样分析，测定结果 RSD 在0.5%~9.5%之间，满足临床测定需求。 表5质控准确度考察结果(n=3) LQC HQC 名称 添加浓度 回收率(%) RSD(%) 添加浓度 回收率(%) RSD(%) (ng/mL) (ng/mL) Melatonin 0.06 94.8 4.1 0.60 84.3 6.9 ALD 0.09 98.2 5.9 0.90 92.0 5.9 COR 3.0 98.3 1.8 30.0 81.3 3.6 F 15.0 100.2 150.0 84.9 4.4 21DOC 0.30 100.8 3.00 99.3 8.0 CORT 0.9 96.6 1.6 9.0 90.4 7.0 S 0.15 104.1 2.3 1.50 82.4 2.0 A4 0.24 93.3 3.9 2.40 81.7 4.1 DOC 0.15 107.1 7.7 1.50 97.6 1.6 T 0.3 93.8 6.2 3.0 83.8 4.3 DHEA 0.9 97.6 7.0 9.0 85.6 4.2 17a-OH-P 0.75 97.0 3.4 7.50 84.9 3.1 DHT 0.06 87.7 1.4 0.60 85.9 3.2 P 0.45 91.3 3.9 4.5 82.9 3.3 LCMSMS-466 Pregnenolone 1.50 109.0 4.4 15.05 94.1 2.2 DHEAS 15.00 96.3 3.1 150.00 94.3 2.2 E3 0.06 87.2 4.1 0.60 82.8 3.9 E2 0.60 92.0 3.3 6.00 82.7 3.8 E1 0.45 99.1 9.5 4.50 84.1 3.2 17-OH-PR 3.00 95.1 2.2 30.00 92.4 2.7 Triamcinolone 4.50 98.0 5.1 45.00 83.5 3.5 Prednisone 1.50 93.9 8.7 15.00 85.8 5.7 Fludrocortisone 1.50 99.7 4.1 15.00 83.5 5.0 Prednisolone 1.50 108.6 4.1 15.00 81.2 3.7 Dexamethasone 1.50 110.7 3.1 15.00 86.1 6.0 Fluorometholone 1.50 112.7 0.5 15.00 97.6 5.5 Methylprednisolone 1.50 116.6 4.3 15.00 86.3 4.8 2.5临床样品测定结果 取6批次血浆样品，按1.3中的前处理方法及1.2中的分析条件进行测定，结果见图4和表6，该方法可满足临床检验需求。 图4 samplel 色谱图 表6临床样品测定结果 (ng/mL) Name samplel sample2 sample3 sample4 Sample5 Sample6 Melatonin 0.010 0.003 0.001 0.006 0.007 0.019 ALD 0.13 0.23 0.06 0.50 0.18 0.06 COR 23.7 13.7 12.3 25.3 23.2 17.8 F 83.5 42.3 29.2 93.1 40.8 78.2 21DOC 0.03 0.04 0.02 0.04 0.02 0.01 CORT 1.5 1.0 0.4 1.4 0.6 1.7 S 0.15 0.08 0.04 0.50 0.21 0.08 A4 1.24 0.93 0.69 2.40 0.11 0.49 DOC 0.01 0.02 0.02 0.07 0.03 0.03 T 0.32 0.18 0.17 0.61 0.03 0.44 DHEA 4.7 2.3 3.4 2.9 0.4 3.1 17a-OH-P 0.46 0.53 1.24 2.24 0.18 1.50 DHT 0.09 0.09 0.04 0.11 0.01 0.14 P 0.06 1.25 7.25 8.18 0.06 6.84 Pregnenolone 0.54 0.28 0.56 0.52 0.09 0.38 DHEAS 876 353 637 311 44 959 E3 0.01 0.01 0.01 0.02 N.D. 0.01 E2 0.02 0.05 0.08 0.49 N.D. 0.13 E1 0.21 0.10 0.19 0.90 0.02 0.26 17-OH-PR 1.7 0.7 1.4 1.1 0.4 1.6 Triamcinolone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Prednisone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Fludrocortisone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Prednisolone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Dexamethasone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Fluorometholone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Methylprednisolone N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 结论 使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用建立了人血浆中27种激素同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法可以为临床人血浆中内源性激素及外源性激素同时检测提供很好的借鉴和参考。 岛津应用云 使用岛津临床用超高效液相色谱仪LC-30A CL与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 CL联用建立了人血浆中27种激素同时测定的方法。使用同位素内标、标准样品及基质加标样品进行了方法的线性、准确度及精密度的考察。结果显示该方法线性范围宽，标准曲线相关系数均大于0.994，方法准确度及精密度均可满足临床日常检验需求。该方法可以为临床人血浆中内源性激素及外源性激素同时检测提供很好的借鉴和参考。