水溶性维生素及其代谢物中不同pH值的各种流动相添加剂的影响检测方案(液质联用仪)

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表 2. LC/MS方法参数 应用简报 Agilent代谢组学 Trusted Answers 水溶性维生素及其代谢物分析 提升使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 进行 LC/MS/MS分析的性能 Rongjie Fu 和Yue Song 安捷伦科技(上海)有限公司 使用配备 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的 LC/MS/MS分析了水溶性维生素及其代谢物，考察了不同 pH 值的各种流动相添加剂的影响。使用 10 mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，在中等pH 值条件下获得了最佳总体性能。使用带有PEEK 内衬的色谱柱硬件和InfinityLab 去活剂添加剂可提高对磷酸化化合物的分析性能。 对水溶性维生素及其代谢物进行全面分析的需求日益增加。大多数分析物为小分子高极性化合物，不能很好地保留在反相色谱柱上。InfinityLab Poroshell 120HILIC-Z 色谱柱采用表面多孔颗粒填料技术，是保留这类化合物的理想选择。本应用简报使用 InfinityLab Poroshell 120HILIC-Z 色谱柱和 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统分离了24种维生素及其代谢物。使用 Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱考察了不同流动相添加剂的影响。此外还考察了同时使用具有 PEEK 内衬的色谱柱硬件和 InfinityLab去活剂添加剂(一种用于减少与活性金属表面相互作用的流动相添加剂)时的效果。将上述结果与标准磷酸清洗方案以及不使用任何钝化策略的传统色谱方法进行了比较。 试剂与化学品 所有试剂均为 HPLC 级或更高等级。HPLC级乙腈购自J.T. Baker (Center Valley， PA，USA.)。水经由 ELGA PURELAB Chorus 系统(High Wycombe， UK) 纯化。甲酸、乙酸、乙酸铵和氢氧化铵购自北京百灵威科技有限公司。所有维生素和代谢物标准品(表1)均购自安谱公司(中国上海)。按表1的浓度和溶剂配制标准储备液。 通过混合各个储备液并采用乙腈进行稀释，配制混合溶液。表1列出了所有组分的单独浓度。 ( 设备与材料 ) ( 色谱柱进样口：Agilent InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头(部件号5067-5965) ) ( 色谱柱出口： Agi l ent InfinityLabQuick Turn 液相色谱接头 (部件号 5067-5966) ) ( Agilent Captiva 经济型过滤器， PTFE膜，直径13mm，孔径0.2 um (部 件号5190-5265) ) ( 安捷伦样品瓶，螺口，棕色，带书 写签，经认证，2mL(部件号5182- 0716) ) ( 安捷伦固定螺口盖，蓝 色 ，带 PTFE/ 红色硅胶隔垫(部件号5190-7024) ) ( Agilent InfinityLab 溶剂瓶，棕色， 1000 mL(部件号9301-6526) ) ( Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶 安全盖，GL45，3口，1个放空阀 (部件号5043-1219) ) ( Eppendorf 移液管和重复用移液器 超声仪(VWR， Radnor， PA， USA) ) 表1.所有分析物的储备液 化合物名称 浓度(mg/mL) 溶剂 混合溶液中的浓度(pg/mL) 硫胺素 1.0 乙腈：水(9：1) 0.16 二磷酸硫胺 1.0 乙腈：水(1：1) 3.4 硫胺素单磷酸酯 1.0 水 3.4 核黄素 0.125 乙醇：1%NH，OH 水溶液 (9：1) 0.43 核黄素磷酸酯 1.0 水 3.4 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 1.0 水 3.4 烟酰胺 1.0 乙腈：水(9：1) 0.04 烟酸 1.0 乙腈：水 (9：1) 3.4 NAD 1.0 乙腈：水(7：3) 1.7 NADH 1.0 乙腈：水(7：3) 6.9 NADP 1.4 乙腈：水 (7：3) 10.8 NADPH 1.0 乙腈：水(7：3) 6.9 D-泛酸 1.0 乙腈：水 (7：3) 3.4 吡哆醇 1.0 乙腈：水 (9：1) 0.04 吡哆醛 1.0 乙腈：水 (9：1) 0.02 吡哆胺 1.0 乙腈：水(9：1) 0.12 吡哆醛-5'-磷酸 1.0 水 3.4 生物素 0.5 乙腈：水(1：1) 1.7 叶酸(FA) 0.5 乙腈：1% NH，OH 水溶液(1：1) 1.7 亚叶酸 0.5 乙腈：水(1：1) 1.7 5-甲基四氢叶酸 0.5 乙腈：水(1：1) 1.7 四氢叶酸(THFA) 0.5 乙腈：水 (1：1) 8.6 二氢叶酸(DHFA) 0.5 乙腈/0.1% NH，OH 水溶液(1：1) 1.7 氰钴胺素(VB12) 0.5 乙腈：水 (1：1) 5.1 ( 仪器 ) ( Agilent 1 290 Infinity ll高速泵 (G7120A) ) ( Agilent 1290 Infinity l l Multisampler (G7167B) ) Agilent 1290 Infinity lI高容量柱温箱(G7116B) Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统 (G6460A) 软件 Agilent MassHunter LC/MS 数据采集软件，版本 B.08.02 Agilent MassHunter 定性分析工作站软件，版本10.0 HPLC条件 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z， 2.1 ×100 mm， 2.7 pm (部件号685775-924)InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z， 2.1×100，2.7 pm， 带 PEEK内衬(部件号675775-924) 储备液 A) 100 mmol/L 甲酸铵水溶液，用甲酸调节 pH 值至3.0 B) 100 mmol/L乙酸铵水溶液 C)100 mmol/L 乙酸铵水溶液，用氢氧化铵调节 pH至9.0 流动相1 A) 100 mL储备液 a 加900mL水 B) 100 mL 储备液 a 加 900mL乙青 流动相2 A) 100 mL储备液b加900mL 水 B)100mL储备液b加900mL乙青 流动相3 A) 100 mL 储备液c加900mL 水 B) 100 mL 储备液c加900mL乙腈 流动相4 A) 100 mL 储备液c 加 900mL水， 加入 1.0 mL 活化剂添加剂 B) 100 mL储备液c加900mL乙腈， 加入1.0mL活化剂添加剂 梯度 0-1 min， 100%B； 1-8 min， B 由100%降至50%； 停止时间：10min 流速 0.30mL/min 柱温 40°C 进样量 0.5 pL 质谱条件 离子模式 ESI/喷射流ESI， 正离子模式/负离子模式 干燥气温度 250°℃ 干燥气流速 6L/min 雾化器压力 35 psi 鞘气温度 325°℃ 鞘气流速 12L/min 毛细管电压 正离子 负离子 3500V 2500V 喷嘴电压 正离子：负离子500V 1000V AEMV OV 考察了三种不同 pH 值的流动相添加剂的影响。随着流动相 pH从3.0增加到7.0，大多数化合物能够保留在 InfinityLabPoroshell 120 HILIC-Z 色谱柱上，使用中性 pH流动相实现了更好的分离。对比pH 7.0 和 pH 9.0流动相，大多数化合物的保留性能变化很小。但是，在正离子模式下，使用中性 pH流动相能够获得比碱性条件下更强的信号。因此，对于图1中的所有化合物，中性 pH 流动相添加剂可实现最佳的整体分离性能。 在研究过程中，磷酸化分子(包括吡哆醛-5'-磷酸、核黄素磷酸酯、二磷酸硫胺和硫胺素单磷酸酯)的峰形较差。当这些化合物与钢质通道(包括泵和钢质管线)相互作用时，在高浓度下将导致峰拖尾，在低浓度下则会完全消失(图2A)。 一种简单的解决方案是对钢表面的金属位点进行去活处理。使用温和的磷酸清洗液(0.5%磷酸，溶于90：10 乙腈：水溶液)进行去活化"。磷酸与系统中的活性位点紧密结合，从而使粘性化合物获得令人满意的分析结果。如图2A和2B所示，用0.5%磷酸清洗后，四种磷酸化分子的峰形均得到改善。 表3.使用多反应监测所监测的质量数 化合物 母离子 子离子 碎裂电压(V) 碰撞能量(V) 极性 烟酰胺 123.1 80.1 100 21 正 吡哆醛 168.1 150 75 9 正 吡哆醇 170.1 152 80 13 正 核黄素 377.2 243 135 25 正 吡哆胺 169.1 152 170 25 正 烟酸 124 80.1 110 21 正 硫胺素 265.1 122 70 13 正 生物素 245.1 227 105 13 正 D-泛酸 220.1 90.1 80 13 正 D-泛酸 218.1 87.9 145 9 负 VB12 678.3 147.1 165 40 正 FAD 786.2 348 180 21 正 核黄素磷酸酯 457.1 439 140 13 正 吡哆醛-5'-粦酸 248 150 135 13 正 NADH 666.1 136.4 180 60 正 NAD 664.1 136.3 175 60 正 亚叶酸 474.2 327 110 17 正 5M-TFH 460.2 313 120 17 正 硫胺素单磷酸酯 345.1 122 85 17 正 FA 442.2 295 95 9 正 DHFA 444.2 178 110 9 正 二磷酸硫胺 425.1 122 95 21 正 THFA 446.2 299 115 17 正 NADP 744 136.4 180 60 正 NADPH 746 136.4 180 60 正 另一种解决方案是添加去活剂添加剂(1mL活化剂，部件号5191-3940或 5191-4506，溶于1L流动相中)2，其可螯合游离金属并覆盖样品流路中裸露的活性金属位点。此添加剂减少了金属与分析物间的相互作用。在向流动相中添加去活剂添加剂之前，请对系统进行相同的磷酸清 洗。如第三张色谱图(图2C)所示，峰形得到进一步改善。作为改善这些化合物峰形的替代解决方案，还使用了带 PEEK内衬的色谱柱并添加去活剂添加剂。如图2D 的色谱图所示，某些化合物的峰形也得到了改善。 ×103 核黄素 ×103 吡哆胺 烟酸 ×103 1.00.5 0 硫胺素 0 ×103 2NADH1 0 ×103 ×102 4NAD212 1 ×10461 生物素 4 2 0 ×103 亚叶酸 0 图1.分析物的选定子离子色谱图 吡哆醛-5'-磷酸 核黄素磷酸酯 二磷酸硫胺 硫胺素单磷酸酯 ×102 Tf= 3.2塔板数=230 Tf=1.9塔板数=974 A 0.80.4 Tf=1.5塔板数=28691 Tf=3.5塔板数=1878 Tf=2.3塔板数=35070 ×10? Tf= 1.4 B C0.80.4 ×102 塔板数=42549 Tf=3.0塔板数=18015 Tf=1.6塔板数=43857 Tf=1.4 塔板数=40735 Tf=1.3塔板数=40651 C 0.8 Tf=1.0塔板数=8007 Tf=1.4 Tf= 1.4 0.4 ×102 0.80.4 塔板数=52100 塔板数=55565 D Tf=1.1塔板数=7886 Tf=1.4塔板数=60095 Tf=1.3塔板数=54100 0 3 4 5 6 7 8 9 4.64.85.0 5.25.45.65.86.0 6.26.06.26.46.66.87.07.27.4 5.75.96.16.36.56.76.97.1 图2.磷酸化代谢物与不锈钢之间的相互作用：清洗前和清洗后。A)系统清洗前；B)系统清洗后，采用 HILIC-Z色谱柱；C)系统清洗后，采用 HILIC-Z色谱柱和去活剂；D)系统清洗后， 采用带 PEEK 内衬的 HILIC-Z色谱柱和去活剂 ( 使用 Agilent I n fintyLab Poroshell 1 20 HILIC-Z 色谱柱和添加了乙酸铵的流动相 (中性pH)，本研究中涉及的水溶性维生素及其代谢物实现了最佳的总体分析性能。用0.5%磷酸(溶于90：10乙腈：水溶液) 冲 洗仪器，并使 用 InfinityLab 去活 剂添加剂， J， 可以显著改善某些磷酸化代谢 物的峰形。具有 PEEK 内衬的 InfintyLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱进一步改善了磷酸化代谢物的峰形。本应用简报中描 述的方法非常适合用于分析水溶性维生素 及其代谢物。 ) ( 1. 亲水相互作用色谱方法开发和故障排除，安捷伦科技公司技术概述，出版 号5991-9271ZHCN， 2018 ) ( 2. I nfinityLab Deactivator A dditive User Guide (InfinityLab 去活剂添加剂用户指南)，安捷伦科技公司，出版号 5991-9516EN， 2018 ) www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 @安捷伦科技(中国)有限公司，2019 2019年11月12日，中国出版 5994-1553ZHCN DE.4472800926 使用配备 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的LC/MS/MS 分析了水溶性维生素及其代谢物，考察了不同 pH 值的各种流动相添加剂的影响。使用 10 mmol/L乙酸铵和乙腈作为流动相，在中等 pH 值条件下获得了最佳总体性能。使用带有PEEK使用配备 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的 LC/MS/MS 分析了水溶性维生素及其代谢物，考察了不同 pH 值的各种流动相添加剂的影响。使用 10 mmol/L 乙酸铵和乙腈作为流动相，在中等 pH 值条件下获得了最佳总体性能。