抗体药物中托珠单抗检测方案(液质联用仪)

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Application No.C216News岛津SHIMADZUhttp：//www.shimadzu.com.cn用户服务热线电话： 800-810-0439第一版发行日：2020年8月400-650-0439 ApplicationNews nSMOL Antibody BA Kit No.C216 利用 Fab 选生性蛋白质酶解法nSMOL进行的抗体药物 LCMSTM 生物分析-7-托珠单抗分析事例- 前言-托珠单抗的免疫结构- 托珠单抗是日本开发的一种人源化白细胞介素6(IL-6)受体的单克隆抗体。其作用机理是“阻断通过与IL-6受体结合、介由IL-6进行的信号传导”。IL-6发现于20世纪80年代，在之后的研究过程中发现与炎症反应和免疫反应等有关，有着各种各样的生理活性。在类风湿性关节炎、卡斯尔门病、幼年特发性关节炎等自身免疫性炎症性疾病当中，发现体内的IL-6产生量异常，因而呈现出过度免疫反应引发的症状。服用托珠单抗，可阻断、抑制异常产生的IL-6所引发的炎症，可以控制以往被视为疑难杂症的疾病症状。此外，针对由IL-6引起的其他疾病，托珠单抗也很可能带来很好的治疗效果，期待其对近来已成为社会问题的新型冠状病毒肺炎等急性炎症的治疗效果。 K. Yokoyama nSMOLTM Antibody BA Kit 的特点 本公司的nSMOL 法是一种可进行单克隆抗体的 Fab 区域选择性酶解，崭新的跨时代 LCMS 预处理法。方法开发可不依存于抗体药物的种类，带来抗体药物分析中的典范转移。此外，本方法还针对多个抗体药物，满足厚生劳动省发布的“关于医药品开发时活体试样中药物浓度分析法的验证指导原则”标准，本公司向您提供各自最佳的方法、方案。 本方法为本公司三重四极型质谱仪LCMSTM-8050(以下称为LCMS-8050)及LCMSTM-8060(以下称为LCMS-8060)进行了优化。 图1nSMOL法的原理 LC-MS抗体药物分析的应用 以往测定抗体药物血药浓度的主流方法是采用配体结合的ELISA 法，但是存在交叉反应和受干扰物质影响。而质谱分析法以结构特异性为指标进行分析，因此可能能够解决上述问题。 此外，伴随近来生命科学领域研究的发展，抗体药物的多样化，现有抗体药物对于各种疾病的适应正在扩大。虽然抗体药物的使用对于以往被视为疑难杂症的各种疾病带来了极大的治疗效果，但是另一方面，还有一部分患者因不断使用而导致治疗效果降低，在这些患者的一部分人中已经发现了抗体耐药药。 基于此背景，预计未来临床研究和生命科学研究中抗体药物的血药浓度测定需求将会提高，使用 LCMS的分析法可能有助于推动这些研究。 图2 LCMSTM-8050(左)及CMSTM-8060(右) 使用nSMOL法的托珠单抗样品处理方案 使用 nSMOL 法可以在同一平台下对所有抗体药物实施预处理。但是，部分抗体会呈现胰蛋白酶反应抵抗性，有时会对测定数据的灵敏度产生较大影响。针对此类抗体药物，可以在胰蛋白酶酶解之前，在酸性条件下进行还原处理，提高反应效率，获得足够的灵敏度。 【样品处理方案】 使用100nm细孔径的 IgG 回收树脂，将存在于血浆或血清中的所有 IgG 固定在树脂细孔中。过滤去除 IgG以外的多余血浆/血清后，添加250mM TCEP-HCI，在室温下孵育30分钟， 以在酸性条件下还原。清洗固定 IgG 的树脂后，加入已键合胰蛋白酶的微细纳米粒子 (FG beads、直径200 nm)，进行酶解。反应后加入反应停止溶液，使用旋转过滤器去除树脂和 FG 珠，可直接供LC-MS 进行分析。 LCMS 分析条件 表1所示为 LC-MS分析的分析条件，表2所示为托珠单抗的定量肽及内标的测定条件。 表1LC 及MS的分析条件 [HPLC条件](NexeraTM X2) 色谱柱 ： Shim-packTM GISS C18 (50 mm×2.1 mm) 柱温箱 ：50°C 溶剂A ：0.1%甲酸水溶液 溶剂B ：0.1%甲酸乙腈溶液 梯度 ：2%B(0-1.5 min)/2-30%B(1.5-4.5 min)/95%B (4.5-5.5 min)/2 %B (5.5-6.5 min) 流速 ：0.4mL/min 进样量 ：10uL [MS 条件] (LCMS-8050/8060) 离子源 ：ESI(正模式) 模式 ： MRM 雾化气流量 ： 3.0L/min 干燥气流量 ： 10.0 L/min 加热气流量 ： 10.0 L/min DL温度 ：250℃ 加热模块温度 ：400℃ 接口温度 ：300℃ 表2托珠单抗的定量肽及内标 肽 MRM 通道 目的 310.2>520.2 定量用 VTMLR 310.2>419.2 结构确认用 P14R 310.2>201.0 结构确认用 512.1>292.3 定量用(IS) 512.1>389.3 结构确认用 512.1>660.4 结构确认用 ※人血浆(血清)中定量范围：0.781~200 pg/mL ※P14R(内标)为在制备胰蛋白酶消化反应液时添加 (最终冬度为10fmol/uL 左右) 托珠单抗的验证结果 表3所示为验证试验项目的准确度、精密度结果，图3所示为标准曲线。此外，图4所示为具有代表性的色谱图。 表3托珠单抗的验证数据(准确度及精密度) 设定浓度 数据平均 准确度 CV [ug/mL] [ug/mL] (%) (%) 第1天 2.34 2.39 102 5.87 (N=5) 160 170 106 1.32 第2天 2.34 2.35 100 3.40 (N=5) 160 166 104 3.83 第3天 2.34 2.59 111 3.32 (N=5) 160 158 98.6 3.50 N=15 2.34 2.44 104 5.92 160 165 103 4.31 图3托珠单抗的标准曲线 图4具有代表性的MRM色谱图(人血清中) 考察、结论 托珠单抗在以往的 nSMOL 法下， 与胰蛋白酶的反应效率不佳，由此可以看出托珠单抗在结构上与胰蛋白酶有局部抵抗。此次，通过在酸性条件下追加还原处理，在0.781~200 ug/mL的范围内开发出定量法，满足厚生劳动省发布的验证指导原则标准。 由此结果得出结论，nSMOL法作为托珠单抗的血药监控技术，具有足够的准确度、精密度。 此外，还通过其他单克隆抗体观察了多次胰蛋白酶抵抗性，分别采取不同方案十分重要。 ( <参考文献> lwamoto N et.al. Analyst ， DOI：10.1039/c3an02104a Iwamoto N e t .al. J Pharm Biomed Anal， DOI： 10.1 0 16/j.jpba.2018.11.019Iwamoto N et al. J Immunol Methods， D OI： 10. 1 016/j.jim.2019.06.014Hashizume M et. a l . Folia Pharmacol Jpn， DOl： 10.1254/fpj.144.172 ) 本文档中描述的产品尚未根据医药和医疗器械法被批准为医疗器械。 岛津应用云 ( 免责声明： ) ( 岛津企业管理(中国)有限公司岛津(香港)有限公司 ) ( *本资料未经许可不得擅自修改、转载、销售； ) ( *本资料中的所有信息仅供参考，不予任何保证。 ) ( 如有变动，恕不另行通知。 ) 托珠单抗在以往的nSMOL法下，与胰蛋白酶的反应效率不佳，由此可以看出托珠单抗在结构上与胰蛋白酶有局部抵抗。此次，通过在酸性条件下追加还原处理，在0.781~200 μg/mL的范围内开发出定量法，满足厚生劳动省发布的验证指导原则标准。由此结果得出结论，nSMOL法作为托珠单抗的血药监控技术，具有足够的准确度、精密度。此外，还通过其他单克隆抗体观察了多次胰蛋白酶抵抗性，分别采取不同方案十分重要。