尿液中5-羟吲哚乙酸中定量检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA20-495Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-547 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS分析人尿液中5-羟吲哚乙酸含量 LCMSMS-547 摘要：本文建立了一种使用岛津高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪测定人尿液中5-羟吲哚乙酸含量的方法。结果表明：5-羟吲哚乙酸在5~5000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.998，各浓度准确度在94.49~106.22%之间；重复性结果显示，峰面积 RSD 为5.58%；加标回收实验中，5-羟吲哚乙酸的回收率在 93.76~111.50%之间。该方法前处理简单、线性范围宽，可为临床检测尿液中5-羟吲哚乙酸提供参考。 关键词：5-羟吲哚乙酸 类癌 LCMSMS 5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid， 5-HIAA)为吲哚乙酸的衍生物，由5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT) 在单胺氧化酶 (Monoamine oxidase， MAO) 作用下转化而来，是人体内重要的活性物质之一。5-HIAA 是哺乳动物尿中的正常组成成分，同时也存在于脑脊液、血小板等体液组织中，最终由尿排出。 临床上将5-HIAA 的过度分泌作为类癌瘤最为特异性的生化指征。类癌 (carcinoid) 是一组发生于胃肠道和其他器官嗜铬细胞的神经内分泌肿瘤，由于类癌细胞释放大量的5-HT，而 5-HT进一步代谢生成5-HIAA，因此类癌患者尿中的 5-HIAA 排泄量显著增高，有报道 可达正常量的5~50倍，甚至百倍以上。 尿液中 5-HIAA的测定方法主要有比色法、 荧光分析法、高效液相色谱法等；质谱法由于其样品前处理简单、不易受尿液中其他药物及代谢物的干扰、线性范围宽、因而能够更好地满足临床需求。 本文使用岛津高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪建立了人尿液中5-HIAA的检查方法。该方法专属性好，灵敏、线性范围宽、回收率高，可供相关检测人员参考。 实验部分 1.1仪器 本实验使用高效液相色谱仪 Nexera X3与三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用系统，具体配置为： 系统控制器： CBM-40 脱气机： DGU-405 输液泵： LC-40BX3 自动进样器： SIL-40CX3 柱温箱： CTO-40C 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GISS (50 mm×2.1 mml.D.，1.9um)， PN： 227-30048-01，岛津(上海)实验器材有限公司 流动相：A相-0.02%FA水溶液，B相-甲醇 流速：0.35mL/min 柱温：35℃ 进样量：1uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱程序见表1。 表1 洗脱程序 Time(min) Module Command Value 0.80 Pumps Pump B Conc. 10 2.00 Pumps Pump B Conc. 95 3.00 Pumps Pump B Conc. 95 3.01 Pumps Pump B Conc 10 6.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器： LCMS-8045离子源： ESI*雾化气流速：3.0L/min加热气流速：10.0 L/min 加热模块温度：300℃ DL温度：250℃ 离子源温度：400℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速： 10.0L/min MRM 参数：见表2 表2MRM参数 序号 化合物 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 1 5-HIAA 54-16-0 192.10 146.15* -15.00 -15.00 -28.00 117.15 -10.00 -38.00 -22.00 *表示定量离子 1.3样品处理 (1)标准工作夜：取5-HIAA对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，作为标准储备液。精密量取标准储备液适量，加甲醇稀释制成0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00、100.00 ug/mL的标准工作液。 (2)标准曲线样品：取纯水95uL， 加入5-HIAA对照品工作液5uL，加入甲醇500 uL， 涡旋 2 min，于12000 rpm 离心10 min 后，取上层青液1uL 进行LC-MS/MS 分析。 (3)尿液样本：取尿液100 uL， 加入甲醇500 uL， 涡旋 2 min， 于12000 rpm 离心10 min 后，取上层清液1uL进行 LC-MS/MS分析。 (4)尿液加标回收率样本：在EP管中分别加入0.15、5.00、10.00、40.00 ug/mL工作液50 uL，氮气流吹干后加入6个不同来源的尿液样本0.5mL，涡旋2 min；取加标后尿液样本100pL，加入甲醇500 uL，涡旋 2 min， 于12000 rpm 离心10 min 后，取上层清液1uL 进行 LC-MS/MS分析。 结果与讨论 2.1专属性考察及标准样品 MRM色谱图 图1 5-HIAA标准样品(蓝色，浓度20ng/mL)与空白溶剂(红色) MRM色谱图 结果显示，空白溶剂对于定量离子监测无干扰。 2.2线性范围 将浓度为5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000 ng/mL标准工作液，按1.2中的分析条件上机分析，，1以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法建立校准曲线，结果如图2所示。 图2 校准曲线 2.3精密度及准确度 对浓度为5、10、1000、5000 ng/mL的标准溶液连续测定6次，考察精密度及准确度，结果如表3所示。 表3 精密度及准确度 理论值 5ng/mL 10 ng/mL 1000 ng/mL 5000 ng/mL AVE 4.38±0.24 9.74±0.45 944.50±10.37 4503.86±9.73 Accuracy% 87.69 97.43 94.45 90.08 RSD(%) 5.58 4.62 1.10 0.22 2.4样本测试结果 共测试28份尿液样本：(28位受试者，同一时间段内采集)结果如表4所示。 表4 样本测试结果 样本编号 浓度 (ng/mL) 样本编号 浓度 (ng/mL) 样本编号 浓度 (ng/mL) 样本编号 浓度 (ng/mL) 1，998.70 8 1，989.42 15 3，438.03 22 3，079.30 2，444.92 9 860.46 16 2，443.36 23 2，705.67 3 2，495.36 10 1，068.72 17 2，025.58 24 2，581.69 4 2，160.24 11 8，289.96 18 2，153.51 25 1，876.40 5 3，798.54 12 2，396.86 19 945.883 26 1，209.75 6 2，593.18 13 34.22 20 6，159.31 27 4，013.42 7 4，740.53 14 7，956.87 21 4，008.66 28 8665.89 测试的28例尿液样本，其5-羟吲哚乙酸含量大多在1000~4000 ng/mL之间(见图3)； 尿液中5-HIAA含量 样本编号 图3样本检测结果 2.5加标回收率 取6个不同来源的尿液样本，按1.2项下(4)处理方式考察加标回收率，结果如表5。 表5 加标回收率 样本 *样本含量 加标量 加标理论值 实测值 平均回收率 ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL (%) 1 34.22±5.52 15 49.22 50.81±4.90 103.24 2 860.46±42.06 500 1360.46 1349.63±84.19 99.20 3 1209.75±24.24 500 1709.75 1782.34±10.02 104.25 4 1989.42±16.56 1000 2989.42 2965.62±113.20 99.20 5 2025.58±25.16 1000 3025.58 3118.72±4.55 103.08 6# 8665.89±396.58 4000 12665.89 12083.01±293.65 95.40 *样本含量为同一尿液样本重复进样测定3次的平均值。 #6号样本含量超出标准曲线范围，因此样本稀释5倍后进样。此处 (8665.889ng/mL) 为稀释后样本x稀释因子-5的回算浓度；实测值为样本加标后稀释5倍，此处浓度为稀释后后本x稀释因子5的回算浓度. 2.6样本处理后稳定性 尿液样本于处理后、处理后放置72H后进样(10℃)，检测结果如表6. 表6样本处理后稳定性(n=3) 编号/项目 0H 72H 计算浓度比值 实测值 (ng/mL) 实测值 (ng/mL) Ratio Average 34.22±4.21 32.37±0.86 0.95 RSD% 12.31 2.65 0.99 Average 860.46±71.03 851.26±13.80 RSD% 8.25 1.62 1.04 Average 2025.58±35.84 2104.42±23.08 RSD% 1.77 1.10 2.7残留考察 在浓度为5000 ng/mL 的标准溶液进样后进空白溶剂，考察系统残留，结果如图4。 图4 5-HIAA标准样品(蓝色， LLOQ 浓度 5 ng/mL)与残留(红色) MRM色谱图 结果显示，系统无明显残留。 结论 本文建立了一种使用岛津高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪测定人尿液中5-羟吲哚乙酸含量的方法。结果表明：5-羟吲哚乙酸在 5~5000 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，重复性和回收率满足生物样本测定的一般要求。该方法前处理简单、线性范围宽，可为临床检测尿液中5-羟吲哚乙酸提供参考。 岛津应用云 5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic   acid，5-HIAA)为吲哚乙酸的衍生物，由5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在单胺氧化酶(Monoamine   oxidase，MAO)作用下转化而来，是人体内重要的活性物质之一。5-HIAA是哺乳动物尿中的正常组成成分，同时也存在于脑脊液、血小板等体液组织中，最终由尿排出。临床上将5-HIAA的过度分泌作为类癌瘤最为特异性的生化指征。类癌(carcinoid)是一组发生于胃肠道和其他器官嗜铬细胞的神经内分泌肿瘤，   由于类癌细胞释放大量的5-HT,而5-HT进一步代谢生成5-HIAA，因此类癌患者尿中的5-HIAA排泄量显著增高，有报道可达正常量的5～50倍，甚至百倍以上。尿液中5-HIAA的测定方法主要有比色法、   荧光分析法、高效液相色谱法等；质谱法由于其样品前处理简单、不易受尿液中其他药物及代谢物的干扰、线性范围宽、因而能够更好地满足临床需求。本文使用岛津高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪建立了人尿液中5-HIAA的检查方法。该方法专属性好，灵敏、线性范围宽、回收率高，可供相关检测人员参考。