曲妥珠、利妥昔、贝伐珠中稳定性检测方案(蛋白稳定性分析仪)

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单抗制剂多维度稳定性分析 郭莎，张峰，于传飞，武刚，崔永霏，王兰*(中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室，北京102629) 摘要：目的 单克隆抗体(单抗)的稳定性是抗体成药性研究中的重要内容，本研究拟探讨从单抗分子的结构稳定性、胶体稳定性、分子间弱相互作用等方面进行稳定性评价的意义。方法 本研究以曲妥珠、利妥昔、贝伐珠为例，从不同角度表征了这3种单抗的稳定性特点，展示了单抗分子稳定性评价的多种维度和思路。首先，通过检测蛋白内源性荧光(intrinsic fluorescence，IF)技术测得熔解温度(melting temperature，Tm)，对抗体分子的结构稳定性进行评估。其次，采用静态光散射技术(static light scattering technique，SLS)预测抗体的胶体稳定性。随后，采用等温稳定性试验(60℃，48h)对样品的稳定性表现进行实时监测。最后，采用动态光散射技术(dynamic light scattering technique，DLS)从蛋白溶解状态下其自身分子间弱相互作用角度预测蛋白聚集倾向。结果 IF技术检测发现3种抗体分子第1个熔解温度 Tm1均在65℃以上，说明其结构均较稳定。SLS 检测显示曲妥珠胶体稳定性最好，升温至95℃未检测到明显的聚集信号，而利妥昔和贝伐珠则在70℃左右出现明显聚集。等温稳定性试验也显示了类似的结果。DLS技术检测显示，曲妥珠的第二维里系数(B，)和扩散相互作用系数(K，)均为正值(3.19×10-和65.46)，预示长期胶体稳定性较好，利妥昔次之，而贝伐珠的B，z和K均为负值(-1.44×10-+和-6.46)，提示蛋白分子间容易自缔合。结论 本研究通过多种技术、从多种角度探讨了单抗药物稳定性评价的内容、层次和深度，为抗体分子筛选、制剂配方优化、抗体分子与制剂配方间的不同组合、稳定性监测等提供了借鉴和参考。 关键词：单克隆抗体；结构稳定性；胶体稳定性；分子间弱相互作用 doi：10.11669/cpj.2021.15.00? 中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1001-2494(2021)15- Multi-Dimensional Stability Analysis of Monoclonal Antibodies ABSTRACT： OBJECTIVETo explore the significance of stability evaluation of monoclonal antibodies (mAbs)， an importantpart of druggability of mAbs， from the aspects of structural stability， colloidal stability and weak intermolecular interaction.METHODS Taking trastuzumab， rituximab and bevacizumab as examples， the stability characteristics of the three mAbs wereexplored from different aspects， thus to demonstrate various dimensions of stability evaluation ofmAbs. Firstly，the structural sta-bility of antibody molecules was evaluated by detecting the melting temperature (Tm) through intrinsic fluorescence(IF). Sec-ondly， static light scattering technique (SLS) was used to predict the colloidal stability of mAbs. Subsequently， isothermal sta-bility tests (60℃， 48 h) were used to monitor the stability performance of the samples in real time. Lastly， dynamic light scat-tering technique (DLS) was used to predict protein aggregation tendency from the point of weak intermolecular interaction of dis-solved proteins. RESULTS IF detection showed that the first melting temperature (Tm) of the three mAbs were all above65℃， indicating that their structures were stable. SLS detection showed that trastuzumab had the best colloidal stability since noobvious aggregation signal was detected at 95 C， while rituximab and bevacizumab showed obvious aggregation at about 70 ℃.The isothermal stability test also showed similar results. The application of DLS techniques showed that the second virial coeffi-cient (B2) and diffusion interaction coefficient (K，) of trastuzumab were positive (3.19×10-3，65.46)， indicating betterlong term colloidal stability， rituximab was suboptimal， while the B22 and K， of bevacizumab were both negative ( - 1.44 ×10-4， -6.46)， suggesting that the molecules were prone to be self-associated. CONCLUSION In this paper， the contents，levels and depth of the stability evaluation of mAbs were characterized by various techniques and discussed from multi-aspects， ( 基金项目：国家科技重大专项重大新药创制项目免疫检查点单抗和其他创新生物技术药的质量评价方法和标准研究资助项目(2018ZX09101001-003)；2020年国家药品标准提高项目课题眼用注射剂的不溶性微粒检测(2020S11) ) ( 作者简介：郭莎，女，副研究员 研究方向：单克隆抗体质量控制研究 * 通讯作者：王兰，女，研究员 研究方向：单克隆抗体质量控制 ) 研究 Tel：(010)53852159 which provides reference for antibody molecular screening， formulation optimization， different combinations between antibody mol-ecules and formulations， stability evaluation and so on. KEY WORDS： monoclonal antibodies； structural stability； colloidal stability； weak intermolecular interaction 单克隆抗体(单抗)是靶向性高、副作用低的一类生物技术药物，自1986年第一例单抗药物(OKT-3)被批准上市以来，至今已有超过40个单抗被美国 FDA批准上市，这些抗体在癌症、自身免疫病、传染性疾病等多种疾病的治疗中发挥了重要作用。治疗性抗体除了需要具备较高的结合亲和力、较好的药代动力学特征、较低的免疫原性等，还需要具有足够的稳定性，体现在单抗分子能承受一定的界面压力、冻融周期、剪切力、温度偏离、光照等不利因素231。抗体药物优良的稳定性能保证抗体在生产、纯化过程中的活性，而且也能保证药物在长期储存、冷链运输、室温使用等过程中的活性，这是提高药物的安全性、延长药物效期、选择灵活的供应链、减少用药限制、提升治疗效果所必需的。而稳定性较差的抗体候选药物，即使具有较高的医学价值，也会大大限制其应有的开发前景。 变性和聚集是抗体药物不稳定的两个主要表现4。变性是指抗体药物的空间结构发生改变，进而导致活性的降低。多种因素可以导致抗体变性，包括温度改变、剪切力增大及其他物理处理过程。例如，某重组 scFv 抗体片段经过20000·s剪切力处理后，其抗原结合活力以0.83·h-的速率降低5。冻干过程也可以造成抗体不同程度的变性，如一种具有免疫原性的抗独特型抗体(MMA383)经过冻干后，因抗体构象改变，其体内免疫原性降低为原来的10%~20%6]。抗体不稳定性的另一个主要表现是聚集，聚集是蛋白受到浓度、黏度、离子强度、pH和温度等的影响，打破了蛋白分子间的平衡状态，使蛋白分子聚合在一起。对于高浓度抗体制剂开发，如何避免蛋白聚集尤其具有挑战性。蛋白聚集通常会降低抗体活力，更重要的是，由于蛋白聚集后抗原表位多样化及抗体构象改变等可能会引起机体过敏反应，轻者可发生头痛、发热，重者可导致肾衰竭等7，因此，稳定性监测便成为了贯穿候选抗体分子筛选、制剂优化、以及生产、储存和运输条件选择等全过程的重要内容。 蛋白熔解温度，也即蛋白半数变性温度(meltingtemperature， T'm)，是检测抗体制剂稳定性的基本参数，用于衡量抗体的结构热稳定性8。Tm 值越高，即蛋白变性所需的温度越高，表示抗体结构热稳定 性越好。目前检测 Tm 的常用方法有差示扫描量热法( differential scanning calorimetry， DSC)和差示扫描荧光法( differential scanning fluorescence， DSF)。DSC 是利用抗体分子变性过程中的吸热或放热反应来确定Tm，该方法稳定性较好，是检测Tm 的先驱和金标，但考虑到样品用量大(毫克级别)、检测通量较低等，因此，更适用于抗体制剂开发后期样品数量较少的阶段及与原研药做比较的情形。DSF分为蛋白内源性荧光( intrinsic fluorescence，IF)和外加荧光染料两两10]。IF通过检测蛋白变性过程中内源荧光氨基酸基团(芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)荧光光谱变化揭示蛋白构象变化，该方法样品用量少，浓度动态范围宽，通量高，用时短，适用于抗体开发和制剂优化过程中大量样品的筛选，不过由于该方法可能会受到蛋白分子中氨基酸组成的影响。外加荧光染料法是利用荧光染料与抗体变性暴露的疏水区区合所发射的荧光来检测 Tm，该方法需要外加染料，而染料可能会影响蛋白聚集过程，故可作为 IF 的补充方案。检测蛋白聚集的技术有分子排阻色一法( size exclusion chromatog-raphy，SEC-HPLC)、静态光散射(static light scatter-ing，SLS)、分析超速离心(analytical ultracentrifuga-tion， AUC)、动态光散射(dynamic light scattering，DLS)和非对称场流分离技术(asymmetric Field FlowSeparation，AF4)等1121。其中 SLS 和 DLS 可以实时检测聚集变化13J，如 SLS可根据升温过程中蛋白分子散射光强的增加检测蛋白起始聚集温度( aggrega-tion temperature，Tagg)，Tagg 值越高，即蛋白开始聚集的温度越高，表示抗体制剂胶体稳定性越高。Tm和 Tagg 是通过加热刺激迅速暴露抗体稳定性差异。除此之外，常用的抗体制剂稳定性评估方法还有等温稳定性试验，即样品在特定温度下保持一段时间，采用 DLS 检测聚集体的平均水化动力学直径及质量占比，基于分子聚集动力学推算抗体长期保存稳定性3。另外，随着抗体制剂向高浓度发展的趋势，浓度因素对抗体聚集的影响日益成为抗体制剂开发人员关注的焦点，这是因为抗体浓度增高可能会改变抗体分子间弱相互作用，进而影响抗体制剂的聚集稳定性14。第二维里系数(the second virialcoefficient，B)和扩散相互作用系数( diffusion inter- action coefficient，K，)是反映蛋白分子间弱相互作用的两个主要参数，通过检测系列稀释抗体溶液中的蛋白-蛋白相互作用，判断候选抗体是否适合做成高浓度制剂，预测抗体制剂的长期稳定性：如果Bz<0，K，<0，则预示抗体分子间存在弱相互吸引，随抗体浓度升高，抗体分子倾向于聚集，不适合制成高浓度制剂或长期放置；如果Bz>0，K，>0，则预示抗体分子间存在弱相互排斥，适合高浓度制剂或长期放置，因此，B，和K的测定可为抗体制剂稳定性评估提供进一步参考151。 本研究以曲妥珠、利妥昔、贝伐珠为抗体制剂稳定性研究模型，结合多种稳定性检测手段对比了3种抗体制剂的稳定性。首先，采用 IF 技术检测3种抗体的Tm，考察结构稳定性；同时应用 SLS 检测起始聚集温度 Tagg，分析其胶体稳定性；在 Tm 与 Tagg结果基础上选择合适温度进行等温稳定性试验；随后又从蛋白分子间弱相互作用角度考察蛋白聚集倾向，预测其长期稳定性。该思路能层层递进地对抗体制剂稳定性进行分析，以期为相关产品的研发和优化提供参考。 1 材料和方法 1.1 样品 3种单抗制剂曲妥珠(21mg·mL-)、利妥昔(10mgmL-)、贝伐珠(25 mgmL-)为中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存。 1.2 仪器 蛋白质稳定性分析仪(型号 Uncle， UnchainedLabs 公司)；台式离心机(型号5417R， Eppendorf公司)。 1.3 方法 1.3.1 Tm、Tagg、平均水化动力学直径及粒度分布检测 取曲妥珠、利妥昔、贝伐珠各9pL，加至样品孔中，每个样品两个重复。升温曲线设置：20~95C，0.3℃·min-'升温，升温过程中同时检测蛋白IF、266 nm 波长的静态光散射(SLS266)和473 nm波长的静态光散射(SLS473)。分别在升温前后通过 DLS 检测抗体平均水化动力学直径(average hy-drodynamic diameter)和粒度多分散性，每个样品检测4次，每次检测5s。试验结束后，根据IF 信号经过荧光光谱的质心波长(barycentric mean，BCM，即全荧光光谱峰积分后峰面积一半时所对应的波长)分析方法得到变性曲线，根据变性曲线确定 Tm；根据 SLS266 或 SLS473 信号变化得到聚集曲线并确定 Tagg；由 DLS 数据得到抗体平均水化动力学直径及粒度多分散性指数( polydispersity index，PDI)。 1.3.2 加速稳定性检测 取曲妥珠，利妥昔，贝伐珠各9uL，加至样品孔中，每个样品两个重复。参数设置：检测温度60℃，检测时长48 h，应用 DLS技术，每隔2482s检测1次(每次检测5s，检测4次取均值得到平均水化动力学直径和 PDI)。试验结束后，得到抗体粒径随时间变化曲线。 1.3.3 B和K检测 用曲妥珠空白制剂稀释初始浓度曲妥珠，得到10、5、2.5 mg·mL-曲妥珠样品；用利妥昔空白制剂稀释初始浓度利妥昔，得到8、6、4、2mg·mL-利妥昔样品；用贝伐珠空白制剂稀释初始浓度贝伐珠，得到20、15、10、5mg·mL贝伐珠样品；然后在台式离心机14000 r·min-离心4 min。每个浓度(含初始浓度)各取9pL样品加至样品管，每个浓度3个重复，另留1孔加空白制剂作为对照。检测温度设置在25℃。试验结束后，软件根据每个浓度点的瑞利比(Rayleigh ratio， Kc/R，)和扩散系数(Diffusion Coefficient)分别求得 B，和Kp. 2 结 男果 2.1 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的结构稳定性和胶体稳定性比较 为了评价3种抗体的结构稳定性和胶体稳定性，本研究基于 IF 检测了 Tm，基于 SLS 检测了Tagg，汇总表详见表1。具体来看，曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的Tm1 均在65℃之上(图1)，属于比较理想的Tm 值，表示结构热稳定性良好。从 Tagg 结果(图2A)来看，曲妥珠在整个升温过程中没有出现明显聚集，胶体稳定性最好；利妥昔的 Tagg 与Tm2 非常接近，说明抗体随第二个结构域发生变性而迅速聚集(图2B)；贝伐珠的 Tagg 比 Tm 略低，SLS 曲线与 BCM 曲线几乎同时急速上升，表示聚集和变性是相伴发生的(图2C)。3个抗体制剂SLS473 曲线叠加(图2D)，可见曲妥珠的聚集程度最低，利妥昔和贝伐珠的 SLS 曲线接近，随着温度升高，散射光强均明显增加，表示两个抗体制剂加热后均形成严重聚集体。3个抗体制剂比较，曲妥珠未出现明显聚集，其胶体稳定更好。本研究还采用 DLS 原理对3种单抗的水化动力学 直径进行表征，随着聚集程度增加，平均水化动力学直径也会增大，汇总结果见表2。具体来看，3个抗体制剂在室温下(20℃)的平均水化动力学直径均 在 15 nm 以内，光强分布也显示均为单一粒径峰(图3)，未出现聚集峰。加热至95℃后(粒径分布图未显示)，曲妥珠的平均水化动力学直径为6.55nm，而利妥昔和贝伐珠的平均水化动力学直径均超过 1(000nm，超出了 DLS的粒径检测范围(0.3~1000nm)，并且两者的粒径分布也很不均 一，表示聚集程度不一。o可见，DLS 结果与 SLS 结果一致，即曲妥珠朱热至95℃时 SLS 强度变化不大，平均水化动力学直径为6.55 nm，说明曲妥珠加热后没有发生明显聚集，胶体热稳定性好；利妥昔和贝伐珠加热至95℃时平均水化动力学直径超出 DLS检测范围，进一步验证了加热后出现严重聚集。 表1 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的T'm 与 Tagg 检测结果.℃，n=4，x±s Tab.1 Tm and Tagg of trastuzumab， rituximab and bevacizumab.℃， n=4，x±s Drug Tml Tm2 Tm3 Tagg266 Tagg473 Trastuzumab 71.6±0.02 81.2±0.02 一 一 Rituximab 66.8±0.02 71.2±0.01 78.8±0.03 69.7±0.01 70.1±0.07 Bevacizumab 71.6±0.02 一 68.4±0.01 68.7±0.04 注：--未测出 Note： --not detect 图1 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的变性曲线图 A -曲妥珠；B-利妥昔； C-贝朱珠.红色虚线所对应的温度为相应 Tm 值，图中所示为4次重复的代表图 Fig.1 The denaturation curves of trastuzumab， rituximab and bevacizumabA -Trastuzumab； B-Rituximab； C -Bevacizumab；the red dashed line indicates corresponding Tm， the graphs are representative of four replicates 图2 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的聚集曲线 A -曲妥珠(SLS266 & SLS473)； B-利妥昔(SLS266 & SLS473)； C-贝伐珠(SLS266 & SLS473)；D-3个集体聚集曲线(SLS473)叠加；虚线所对应的温度为相应 Tagg值；图中所示为4次重复的代表图 Fig. 2 The aggregation curves of trastuzumab， rituximab and bevacizumab 表2 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠在升温前后的平均水化动力学直径. n=4，x±s Tab. 2 The average hydrodynamic diameter of trastuzumab，rituximab and bevacizumab before and after temperature in-crease. n=4，x±s oBefore temperature pAfter temperature Drug increase (20℃) increase(95℃) /nm /nm Trastuzumab 3.41±0.27 6.55±0.13 nm Rituximab 11.01±0. 13 Aggregated severely，DLS not applicable Bevacizumab 13.92±0.33 Aggregated severely，DLS not applicable 图3 20℃时曲妥珠、利妥昔和贝贝珠的 DLS 光强分布图图中所示为4次重复的代表图 Fig. 3 The DLS intensity distribution of trastuzumab， rituximaband bevacizumab at 20℃ The graphs are representative of four replicates 2.2 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的等温稳定性结果 等温稳定性试验可以实时监测样品聚集的动态变化，也能及早发现蛋白聚集动力学差异。本研究采用 DLS 原理对等温稳定性试验中的平均水化动力学直径和 PDI进行了监测，平均水化动力学直径变大，表示蛋白发生了聚集。PDI是表征粒径分布的参数，粒径分布越均一，其值越小，粒径分布越不均一，其值越大。此外，由于本文所使用的三种单抗Tm 值均较高，故采用比Tm1低约5℃的温度，即60℃这个相对较高的温度来进行考察，结果如图4所示。曲妥珠经过60℃孵育48 h，其平均水化动力学直径和PDI基本保持不变，且 PDI值相较利妥昔和贝伐珠始终偏低(0.3左右)；利妥昔和贝伐珠单抗的平均水化动力学直径随孵育时间延长呈现上升趋势，约1.2×10's前上升速率接近，1.2×10's后贝伐珠单抗平均水化动力学直径随时间继续上升，利妥昔平均水化动力学直径相对平稳。利妥昔的PDI自始至终都比较大，在1左右波动；贝伐珠单抗的 PDI 随孵育时间而增大，4×10s左右增大至1.5左右，随后基本保持平稳。平均水化动力学直径和 PDI 结果也均显示曲妥珠样品胶体稳定性较好。 图4 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的在60℃下加热48h的等温稳定性结果.n=3 A-平均水化动力学直径随时间变化曲线； B-PDI随时间变化曲线 Fig.4 The isothermal stability of trastuzumab， rituximab and bevacizumab in the process of heating at 60 ℃ for 48 h. n=3A -The curve of average hydrodynamic diameter versus heating time； B -The curve of PDI versus heating time. The graphs are representative of three replicates 2.3 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的分子间弱相互作用 本文采用 DLS 原理检测了B，和Kp，用以反映蛋白分子间弱相互作用，结果见图5。曲妥珠的Bzz和K均为正值(3.19×10-和65.46)(表3)，表示分子间存在弱的相互排斥力，或者说制剂条件更有利于蛋白-溶剂相互作用，预示长期放置倾向稳定。贝伐珠的B和K，均为负值 (-1.4×10和-6.46)表示蛋白分子间容易自缔或未完全稳定地溶解于制剂。利妥昔的B，为1.7×10-4，虽然为正值但是曲线接近水平，表示抗体分子间存在非常弱的相互排斥，但是K，为-10.84，表示可能由于制剂因素(缓冲体系、盐离子强度、辅料添加剂等)导致蛋白扩散作用减弱，有聚集风险。 图5 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的Bz2与Kp检测曲线.n=3 A-B22曲线； B-Kp曲线 Fig.5 The B22 and Kdetecting curves of trastuzumab， rituximab and bevacizumab. n=3A - Curves of B22； B-Curves of Kp 表3 曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的 Bz2与K结果. n=3 Tab.3 The B22 and Kp results of trastuzumab， rituximab and bevacizumab. n=3 Drug Concentration B22/mol· mL· g Fit quality of B22 Concentration Kp/mL·g Fit quality of Kp Trastuzumab 3.19×10-3 0.827 65.46 0.934 Rituximab 1.7×10-4 0.904 -10.84 0.979 Bevacizumab -1.44×10-4 0.848 -6.46 0.963 图6 Lumry-Eyring 模型示意图 由于不同性质和特点，蛋白质在加热过程中可以从天折叠然状态(A)可逆转变为解折叠状态(B)，也可以从解折叠状态转变为不可逆聚集状态(D)；另外也可从天然状态(A)直接转变为不可逆聚集状态(C).检测加热解折叠过程可考察蛋白构象稳定性(A-B)，而静态光散射强度或动态光散射的尺寸信息可反映蛋白胶体稳定性( A-C 或 B-D) Fig.6 Schematic diagram of the Lumry-Eyring model Proteins can be reversibly transformed from the natural state (A) to the unfoldedstate (B)， then from the unfolded state to the irreversible state of aggregation(D)， or directly from the natural state (A) to the irreversible state of aggregation(C). The protein conformational stability (A-B) can be examined by detecting theprocess of unfolding with temperature increase， while the size information from stat-ic light scattering intensity or dynamic light scattering can reflect the protein colloi-dal stability (A-C or B-D) 3 讨fi论 Tm 可以反映抗体的结构热稳定性，通常与抗体制剂的长期稳定性有很高的的相关性，但它只是 蛋白制剂稳定性的一个方面，抗体制剂长期稳定性还与多种因素有关，如胶体稳定性、热动力学、分子间弱相互作用、化学降解等，需要综合多个角度全面考察抗体制剂的稳定性。其中，抗体制剂的胶体稳定性即聚集稳定性也是影响抗体长期储存的重要因素。本文在检测曲妥珠、利妥昔和贝伐珠3种抗体Tm 的同时也检测 Tagg，用来反映胶体稳定性。Tagg 越高通常表明抗体胶体稳定性越好，不易聚集，反之则蛋白容易聚集。Tm 与 Tagg 同时检测的另外两个重要意义，一是在于可以提示变性与聚集的关系，甚至可以具体提示聚集与抗体哪一个结构域的变性关系最大，从而有针对性地提高结构稳定性以降低聚集倾向1161。本研究将3种抗体的变性曲线与聚集曲线叠加发现，利妥昔的聚集曲线在m2 附近开始迅速上升，表示利妥昔聚集是由于Tm2对应的结构域解折叠造成的，非常直观地揭示了变性与聚集的关系。这种变性与聚集的关系在贝伐珠单抗上也得到体现。在抗体制剂稳定性分析中，如果抗体结构不稳定，加热就容易发生解折叠(图6A-B)，使疏水区暴露，进而诱发不可逆聚集过程(图6B-D)，这种情况可以从优化蛋白结构稳定性出发优化蛋白稳定性；如果抗体Tm 较理想，但是Tagg 很低，说明蛋白容易聚集，但不是由结构不稳定造成的，提示有可能是制剂等因素不利于胶体稳定性，造成蛋白天然状态下发生不可逆聚集(图6A- C)，因此需要从优化制剂处方出发提高制剂稳定性。了解抗体变性与聚集的关系的另一个重要意义在于，提醒研究人员理性对待变变温度Tm 的意义。如果变性发生在聚集之前，Tm 对蛋白结构稳定性的反映是比较可靠的；如果Tm 远在 Tagg 之后，表明蛋白先有聚集，而聚集会干扰蛋白变性过程的检测，即检测到的“表观”Tm究竟是变性的影响还是聚集的影响不容易判断，需要结合其他方法验证。通过调研文献和总结试验经验发现，很多已有抗体稳定性数据仅提供Tm 数据且比较高(如80~90℃)，而未见聚集信息，此时需要注意聚集对 Tm 检测造成的干扰。 继抗体的结构稳定性和胶体稳定性后，接下来从聚集动力学角度考察3种抗体制剂的稳定性，即等温稳定性试验。在低于蛋白初始变性温度3~5℃的条件下(对于本试验抗体制剂而言为60℃，蛋白尚未变性)持续观察48 h，实时记录抗体平均水化动力学直径的变化，平均水化动力学直径增大表明抗体发生聚集，保持不变表示未发生明显聚集。结果显示曲妥珠在等温试验过程中粒径基本保持不变，利妥昔和贝伐珠则表现出明显的平均粒径增大，三者相比曲妥珠的聚集速率慢，胶体稳定性较好。 随后本文又进一步从抗体分子间弱相互作用角度考察三个抗体制剂的稳定性(25℃条件下)，蛋白非特异性弱相互作用与蛋白制剂筛选和蛋白的生物物理特性(如溶解性、黏度、聚集倾向)有着显著的相关性，在生物制品领域对蛋白分子的弱相互作用研究非常重视1171。非特异性蛋白弱相互作用由多种因素引起，如分子排斥(hard-core molecular repul-sion)、蛋白表面净电荷(net charge)疏水区(hydro-phobic patches)、范德华力、氢键等。分子间弱相互作用不同于特异性的结合作用，只有当蛋白浓度超过1mg·mL的时候才需要考虑其对蛋白制剂稳定性的影响。随着蛋白浓度增加，分子间弱相互作用可能会发生转变(相互吸引和相互排斥转变)。B，，是描述非理想稀释溶液中溶质-溶质间弱相互作用的参数，正被广泛应用于预测蛋白溶液的溶解度、黏度、结晶倾向和蛋白制剂胶体稳定性。常用的B，，分析方法有静态光散射(SLS)、分析型超速离心机(AUC)、动态光散射(DLS)和膜渗透压测量法等118-19。K，是研究蛋白分子间弱相互作用的另一个重要参数，在过去十年间关于K 与蛋白溶液生物物理特性(聚集倾向、黏弹特性等)相关性的研究，尤其是在高浓度蛋白制剂开发领域越来越被认 可115。He等通过K，研究了单抗制剂胶体稳定性20]，Connolly 等17]通过检测稀释溶液的K，成功预测了高浓度制剂的黏弹性，为早期选择黏度性质良好的单抗候选分子进行高浓度制剂开发提供了依据。已有文献[19]报道K，与抗体聚集动力学结果(SEC-HPLC)有相关性。本研究利用 DLS 技术在室温状态下(25℃)同时检测3种抗体制剂的B，和K，，综合分析结果发现曲妥珠制剂分子间存在弱相互排斥，胶体稳定性高，贝伐珠单抗间存在弱相互吸引，胶体稳定性差，结果均与 Tagg、等温稳定性实验结果一致，证明了 Bz、K对于预测抗体制剂长期稳定性的意义。利妥昔K，为负Bz为正，看似矛盾，其实是正常现象，两个参数意义不同，B，z以考察分子间弱相互作用为主，而K，则受到溶液成分的干扰，若二者结果指向不一，则以B，，为准来预测抗体制剂长期稳定性19J。 文中数据是对蛋白稳定性进行预测的参数和维度，而实际检测中，也发现曲妥珠、利妥昔和贝伐珠的 SEC-HPLC 结果差异，三者的单体纯度分别在99.0%98.0%96.0%以上，略呈递减趋势，说明贝伐珠聚集体含量略高。从文献211中也了解到3种单抗的稳定性试验数据，曲妥珠在4℃和室温下放置6个月，从粒径和高级结构数据看，其构象稳定，无聚集发生，这与本研究中曲妥珠各维度的检测结果所显示的较好稳定性一致，如加热至95℃时和60℃加热48h 并并未检测到聚集等。利妥昔在4℃下放置6个月后粒径和高级结构未检测到变化，说明稳定性也不错，只是在40℃下放置3个月后DLS 检测到聚集体22J.文中也显示利妥昔在60℃加热48h的过程中出现聚集；贝伐珠在4℃下放置8个月后， DLS 粒径分布已显示聚集体增多[23]，这与本研究中B，和K 结果预示贝伐珠的聚集倾向是一致的。可见试验结果与文献中实际的稳定性数据是有相关性的，也是具有一定的预测性的。 本研究仅以3种上市单抗制剂为稳定性研究对象，从Tm、Tagg、粒径与多分散性、聚集动力学及分子间弱相互作用预测长期稳定性角度，由加热、加速到室温检测，多种条件下层层递进分析稳定性，检测的多种稳定性参数结果较一致。然而其他分子不同参数的结果并不一定都会如此一致，这是由于稳定性是一个复杂的蛋白生物物理特征，体现在多种维度，与多种因素相关，不同参数是从不同角度对稳定性进行表征，在某一方面较优并不代表在其他方面也较优，因此，在抗体分子筛选、制剂开发、分子与制 剂的不同组合以及储存稳定性监测等过程中，也应从多方面进行稳定性评价，综合各角度的结果进行全面而合理地评价。本研究论述的部分抗体稳定性分析方法，如检测 Tm、Tagg、等温稳定性在病毒产品，如病毒疫苗和AAV 载体领域也有验证和应用[24]。除此之外，稳定性参数之间的相关性及其与长期稳定性之间的相关性需要更大量的样品以及更系统的研究，目前已有文献报道可以基于B，，和Tagg，通过非线性回归分析来预测40℃加速试验单体占比，进而缩短制剂筛选时间25]。因此，基于现有方法和仪器对抗体制剂稳定性进行分析，一方面是对抗体制剂质量的监测控制，更重要的意义在于探究抗体分子实际的长期稳定性表现与稳定性检测方法和参数之间的相关性，为抗体分子的可开发性评估、抗体制剂处方筛选等节省宝贵时间和资源。 ( REFERENCES ) ( [ 1] RYMAN J T， MEIBOHM B. 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J Pharm Sci ， 2020，109( 1 )：308- 315. ) ( (收稿日期：2020 - - ) ) ·中国药学杂志第第期Chin Pharm J， August， Vol.No. 目的　单克隆抗体（单抗）的稳定性是抗体成药性研究中的重要内容，本研究拟探讨从单抗分子的结构稳定性、胶体稳定性、分子间弱相互作用等方面进行稳定性评价的意义。方法　本研究以曲妥珠、利妥昔、贝伐珠为例，从不同角度表征了这3种单抗的稳定性特点，展示了单抗分子稳定性评价的多种维度和思路。首先，通过检测蛋白内源性荧光（intrinsic fluorescence, IF）技术测得熔解温度（melting temperature, Tm），对抗体分子的结构稳定性进行评估。其次，采用静态光散射技术（static light scattering technique, SLS）预测抗体的胶体稳定性。随后，采用等温稳定性试验（60℃, 48h）对样品的稳定性表现进行实时监测。最后，采用动态光散射技术（dynamic lights scattering technique, DLS）从蛋白溶解状态下其自身分子间弱相互作用角度预测蛋白聚集倾向。结果　IF技术检测发现３种抗体分子第１个熔解温度Tm1均在65℃以上，说明其结构均较稳定。SLS检测显示曲妥珠胶体稳定性最好，升温至95℃未检测到明显的聚集信号，而利妥昔和贝伐珠则在70℃左右出现明显聚集。等温稳定性试验也显示了类似的结果。DLS技术检测显示，曲妥珠的第二维里系数（B22）和扩散相互作用系数（KD）均为正值（3.19*10-3和65.46），预示长期胶体稳定性较好，利妥昔次之，而贝伐珠的B22和KD均为负值（-1.44*10-4和-6.46），提示蛋白分子间容易自缔合。结论　本研究通过多种技术、从多种角度探讨了单抗药物稳定性评价的内容、层次和深度，为抗体分子筛选、制剂配方优化、抗体分子与制剂配方间的不同组合、稳定性监测等提供了借鉴和参考。关键词：单克隆抗体；结构稳定性；胶体稳定性；分子间弱相互作用