牛奶中四环素类化合物检测方案(固相萃取仪)

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自动化样品前处理解决方案-RKFT-F006 解决方案 牛奶中四环素类化合物的检测 关键词 全自动固相萃取；高效液相色谱法；黄曲霉毒素M1 介绍 四环素类抗生素(图-1)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，由于实用性高且价格低廉，在畜禽养殖和饲料添加剂等方面得到了广泛的应用。近年来，我国畜牧业发展迅速，动物疾病越来越复杂，兽药和抗生素饲料添加剂的使用量也日渐增加。由于药物滥用，导致了畜禽中有大量的抗生素残留，严重影响了乳制品的质量安全。如果人类长期食用这种含有抗生素残留的乳制品，可能导致牙齿变黄，形成“四环素牙”，甚至会使指甲和巩膜变色，对身体健康产生严重伤害。 本实验参考国标《GB/T 21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-串联质谱法与高效液相色谱法》，建立了基于睿科Fotector Plus全自动固相萃取分析乳制品中四环素类抗生素的检测方法。 图-1.四种四环素类抗生素结构图 1.仪器与耗材 仪器和耗材 睿科Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260， 质谱检测器(MS) Agilent 6410 HLB 固相萃取柱 (RayCure， 60mg/3mL， 货号：RC-204-36473) 甲醇(优级纯)，乙酸乙酯(优级纯)，超纯水 5%甲醇水溶液：量取5mL 甲醇用超纯水定容至100mL 10%甲醇乙酸乙酯溶液：量取10 mL甲醇用乙酸乙酯定容至100mL Na2EDTA-McIlvaine(0.1mol/L)缓冲溶液(pH=4.0)：准确60.2g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠 17.8g 和柠檬酸 21.0g与烧杯中，加入1000mL 的纯净水，加入浓盐酸调节 pH 值至4.0 将1000.0mg/mL 的单标储备液取出，于室温平衡后用 Auto Prep 200全自动羊体样品处理工作站配成浓度为 0.02、0.04、0.10、0.20、0.50Hg/mL 的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL 目标位 目标浓度 目标体本(mL 溶剂 洗针溶剂 1 填充管路 3.00 30%甲醇水 2 配液 A1-4 1000.00 1.50| A21 10.00 1.00 30%甲醇水 30%甲醇水 3 直接稀释 A21 10.00| 1.00| A22 1.00| 1.00 30%甲醇水 30%甲醇水 4 直接稀释 A22 1.00 1.00| A31 0.02 1.00 30%甲醇水 30%甲醇水 5 直接稀释 A22 1.00| 1.00 A32 0.04 1.00 30%甲醇水 30%甲醇水 6 直接稀释 A21 10.00 1.00| A33 0.10 1.00| 30%甲醇水 30%甲醇水 7 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A34| 0.20 1.00 30%甲醇水 30%甲醇水 8 直接稀释 A21 10.00| 1.00 A35 0.50| 1.00| 30%甲醇水 30%甲醇水 9 方法结束 图-2.Auto Prep 200 液体工作站配标程序 3.样品制备与净化 3.1样品提取 称取5g牛奶样品置于50mL 比色管中，用0.1mol/L NaEDTA-McIlvaine 缓冲液溶解并定容至50mL，涡旋混合 lmin，冰水浴超声10min， 转移至50mL 离心管中。以8000r/min离心10min(温度设置为4℃)，准确量取10mL上清液转移至80mL 玻璃上样管中，待净化。 3.2固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 HLB柱 (RayCure，60mg/3mL) 活化 甲醇，超纯水 淋洗 水，5%甲醇水溶液 洗脱 10%甲醇乙酸乙酯溶液 分别以5mL 甲醇和5mL 水活化 HLB柱，将上述提取液以2mL/min 的速度进行上样，并用3mL水清洗样品瓶。以3mL 水和 5mL 5%甲醇水对固相萃取柱进行淋洗。用气推将柱子推干，最后以10mL 10%甲醇乙酸乙酯溶液洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图-3)。将洗脱液用 Raykol EVA 80 全自动平行浓缩仪于40℃条件下浓缩至近干，以30%甲醇水溶液定容至1mL， 涡旋混合，过滤膜上机检测。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间min， 1 青洗样品通道 甲醇 2.8 2 活化 甲醇 有机废液 3 5 2.1 3 活化 水 废水 3 5 2.1 4 上样 废水 2 10 5.8 5 青洗样品瓶 水 废水 60 3 2.3 6 林洗 水 废水 3 3 1.4 7 林洗 5%甲醇水 有机废液 3 5 2.1 8 气推 有机废液 80 30 2.2 9 清洗注射泵 10%甲醇乙酸乙酯 60 3 0.5 10 洗脱 10%甲醇乙酸乙酯 收集 2 10 5.8 11 气推 收集 10 10 1.8 12 结束 图-3. Fotector Plus 四环素固相萃取净化方法 4.检测条件 4.1 液相色谱条件 表-2色谱检测条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5umx21 mmx50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mM ammonium acetic(0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 30°C 进样体积 10 pL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI+ 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 0.0-0.50 min， 80%流动相A； 0.50-2.0 min， 30%流动相A； 2.0-4.0min，30%流动相A； 4.00-4.10 min， 90%流动相A； 4.10-7.0min，90%流动相A。 4.2 MRM 参数 表-3.4种四环素的串联质谱检测参数 CompoundName Precursorion Product10n Dwell Fragmentor Collision Energy Cell AcceleratorVoltage 四环素 445.2 427.1 40 120 6 7 410.1 40 120 14 7 154 40 120 26 7 土霉素 461.2 443.2 40 115 8 7 426.1 40 115 12 7 金霉素 479.2 444.1 40 120 18 7 462 40 120 12 7 强力霉素 445 428.1 40 125 14 7 321.1 40 125 30 7 267.1 40 125 38 7 4.3 MRM色谱图 下图为四种四环素类化合物标准溶液在液质上的质谱图： 5.样品测试 为了验证该方法的回收率，本实验向牛奶样品(5g)中加入4种四环素标准品(40uL， 1mg/L)进行加标回收验证(n=3)。测试结果如表-2所示，4种四环素的回收率在71%-89%之间， RSD 值均控制在10%以内。 说明该方法能够很好地用于牛奶中4种四环素的检测。 表-4.牛奶样品加标回收率及 RSD 值(40 ug/kg) 化合物 回收率(%)样品-1 回收率(%)样品-2 回收率(%)样品-3 平均回收率(%) RSD(%) 四环素 84.1 82.3 76.2 80.9 5.1 土霉素 85.2 88.3 80.4 84.6 4.7 金霉素 83.5 76.2 77.8 79.2 4.8 强力霉素 71.8 79.3 73.3 74.8 5.3 6.结果与讨论 使用睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪采用全自动操作，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时 Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180 个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 睿科EVA 80 全自动平行浓缩仪通过独特的针自动追随液面技术可以极大地减少氮气使用量，同时避免手动氮吹需要经常调节氮吹针高度带来的麻烦。 全自动液体样品处理工作站标曲配制 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 RayKol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.，Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2021年10月版 热线：址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com GB/T 21317-2007 动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法 建立了基于全自动固相萃取分析乳制品中四环素类抗生素的检测方法