血清中胰岛素样生长因子1（IGF-1）检测方案(液相色谱仪)

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SSL-CA20-649Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-577 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn 临床 LC-MS/MS 结合固相萃取法用于人血清中胰岛素样生长因子1(IGF-1)的测定 LCMSMS-577 摘要：使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合固相萃取法，建立了人血清中完整胰岛素样生长因子1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数大于0.99，准确度及精密度均满足要求。该方法对于临床上生长激素素乏症、肢端肥大症的诊断及治疗疗测具有重要的意义。 关键词：LC-MS/MS血清固相萃取法 IGF-1 胰岛素 胰岛素样生长因子-1 (insulin - like growthfactor-1， IGF-1)亦称为生长介素，是一种小肽类激素，结构与胰岛素原相似，其分子量为 7.6kDa。 IGF-1的重要作用之一是介导生长激素(GH)在外周靶器官组织的促生长作用。 血清 IGF-1的测定具有重要的临床意义，随着对IGF-1认识的不断探索，其在临床中的应用逐渐扩大。最初 IGF-1的测定主要用于矮小儿童、成人生长激素缺乏症以及肢端肥大症的诊断，监测儿童和成人 GH替代的疗效及安全性，监测肢端肥大症的治疗反应。大量 流行病学研究发现， IGF-1与肺癌、乳腺癌等多种肿瘤相关，提示血清 IGF-1可能成为肿瘤监测的指标 之一。此外，有研究发现系统性硬皮病患者血清 IGF-1和 IGFBP-3水平升高，提示 IGF 系统可能参与了系统性硬皮病的发病机制。 IGF-1的检测方法主要是基于免疫学的测定方法，包括放射免疫法、ELISA 法、化学发光法以及近年来新兴的质谱法。免疫法的关键问题在于 IGFBP 对于 IGF-1的干扰，质谱法与免疫法相比具有更好的特异性，，可以有效降低交叉干扰，测定结果更加稳定准准。 本文使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合固相萃取法，建立了人血清中 IGF-1含量测定方法，该方法分析速度快，灵敏度高，专属性强，可用于临床中相关疾病的诊断，对于IGF-1的临床研究亦有重要意义。 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050CL联用系统。具体配置为： 输液泵： LC-30AD CL×2在线脱气机： DGU-20A5R CL自动进样器：SIL-30ACMP CL柱温箱： CTO-30A CL系统控制器： CBM-20ACL工作站： LabSolutions Ver. 5.99 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 100 mm×2.1 mm l.D.， 1.7 um 流动相：A相-0.1%甲酸水，B相-0.1%甲酸乙腈 柱温：55C 进样量：10uL 流速：0.4 mL/min 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，洗脱程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.50 Pumps B.Conc 30 3.50 Pumps B.Conc 50 3.51 Pumps B.Conc 95 4.00 Pumps B.Conc 95 4.01 Pumps B.Conc 20 5.00 Controller Stop 质谱条件： 分析仪器： LCMS-8050 CL 离子源：ESI(+) 雾化气流速：2.0L/min 干燥气流速：10.0 L/min DL温度：250℃加热模块温度：400℃接口温度：300℃扫描模式：多反应监测(MRM) 加热器流速：10.0 L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 名称 英文名 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE (V) Q3 Pre Bias (V) 胰岛素样生长因子-1 IGF-1 1093.5* 1093.5* -44 -37 -34 1196.4 -42 -40 -38 胰岛素样生长因子-1内标 N-IGF-1 1106.9 1106.9* -42 -15 -40 1211.2 -42 -35 -40 注： 66*79表示定量离子。 1.3标准样品、质控样品及内标溶液配制 用纯水溶解配制 100 ug/mLIGF-1储备液，分装，-80℃冻存，待用。取其中一份储备液用50%甲醇水溶液逐级稀释成浓度为0.2、0.5、1、2.5、5、10、16、20 ug/mL的标准工作曲线和浓度为0.3、6、15 ug/mL的质控溶液。分别取标准工作曲线中各浓度点5 uL加入95 uL人空白血浆中，依次配制成浓度为10、25、50、125、250、500、800、1000 ng/mL 的标准样品；分别取三个不同浓度质控溶液 5 uL加入95 pL人空白血浆中，依次配制成浓度为15、300、750 ng/mL 质控样品。 用纯水溶解配制浓度为100 ug/mL 的15N-IGF-1储备液，分装，，-80℃冻存，待用。将配制好的I5N-IGF-1储备液用50%甲醇水溶液稀释为 5 ug/mL内标溶液，待用。 1.4人血清样品前处理方法 a)取人血清样品100pL， 加入内标溶液20uL， 涡旋混匀； b)加入100 uL8M尿素溶液，涡旋混匀，室温静置15 min； c)加入200 uL20℃预冷的乙腈(含5%乙酸)，涡旋混匀，14000rpm 离心5 min； d)吸取 300 uL 上清液与 900 uL 5%氨水溶液混匀； e)吸取混合液加入已活化的96孔固相萃取板，用200 uL5%氨水溶液和200 uL 5%甲醇水溶液进行清洗除杂，再用50 uL 60%甲醇水溶液(含2%甲酸)洗脱两次。收集全部洗脱溶液至96孔板中涡旋混匀，进样分析。 结果与讨论 2.1 MRM 色谱图 图1标准样品(10ng/mL)及空白样品谱图 标准样品及空白样品谱图如图1所示，IN标记的IGF-1会在保留时间之前出现另一个峰，据文献报道，此色谱峰是由于结构中不同的二硫键构型导致的另一种蛋白形态，通过还原和烷基化可转化为一个峰。从图中可以看到空白样品对IGF-1及内标的检测均无干扰，方法专属性良好。 2.2线性测定结果 标准样品经过1.4中的前处理后按1.2中的分析条件进行分析，内标法制作标准曲线。标准曲线结果见表3，线性相关系数为0.9968，准确度在91.6%~113.5%之间，满足测定需求。 表3 标准曲线结果 编号 名称 线性方程 线性范围 (ng/mL) 相关系数 准确度(%) 1 IGF-1 Y=(0.0005086070)X+(0.001737651) 10~1000 0.9968 91.6~113.5 图2标准曲线 2.3准确度及精密度测定结果 按1.4中的前处理方法对低中高三浓度质控样品进行前处理，按1.2中的分析条件对质控样品进行分析，每个样品平行制备6份，质控品的准确度及精密度结果如表4所示，结果显示质控品测定准确度结果与理论值接近，均在理论值的±20%范围内，满足临床测定需求。样品平行制备6份进样分析，测定结果RSD在2.1%~6.7%之间，满足临床测定需求。 表 4质控样品准确度及精密度考察结果(n=6) 样品类型 理论浓度 (ng/mL) 准确度% 精密度 RSD% LQC 15 105.7 6.7 MQC 300 116.4 2.1 HQC 750 88.9 6.3 结论 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合固相萃取法，建立了人血清中胰岛素样生长因子-1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数为0.9968，准确度及精密度均满足临床要求。该方法可供生长激素缺乏症、肢端肥大症等多种疾病的诊断、治疗监测和临床研究参考。 ( <参考文献> ) ( 【1】】 P ratt， M.S.， van Faassen， M.， Remmelts， N . et al. An antibody-free LC-MS/MS method for t he quantification ofintact insulin-like growth factor s 1 and 2 i n human plasma. Anal Bioanal Chem 413 ， 2035-2 0 44 (2021). https：//doi.org/10.1007/s00216-021-03185-y ) 岛津应用云 使用岛津临床液相色谱质谱联用系统结合固相萃取法，建立了人血清中胰岛素样生长因子-1测定的方法。并对方法的线性、准确度及精密度进行了考察。结果显示该方法线性良好，标准曲线相关系数为0.9968，准确度及精密度均满足临床要求。该方法可供生长激素缺乏症、肢端肥大症等多种疾病的诊断、治疗监测和临床研究参考。