单克隆抗体中分析表征检测方案

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应用笔记网址： www.separation.asia.tosohbioscience.com 使用半制备型 FcR 亲和色谱柱和 HILIC-MS 表征单克隆抗体 单克隆抗体(mAb) 是一类重要的治疗药物，拥有治疗多种疾病的巨大潜力。由于其结构具有高度复杂性和聚糖异质性，因此必须对其关键质量属性进行表征和严格控制，才能保证药物的质量和功效。与 Fc 区 Asn-297 糖基化位点相连的 mAb 聚糖会影响生物活性，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC) 和稳定性。 TSKgel@ FcR-IIIA 色谱柱根据单克隆抗体对 FcyRIIIA 配体的亲和力，将其分为3个组分：低亲和力、中亲和力和高亲和力。这主要取决于 mAb 的糖型及其 ADCC 活性。为了定量和阐明基于 FcR-ⅢIA 亲和力分离的不同组分糖型聚糖谱，需要首先对馏分中的抗体聚糖进行释放并标记，再使用 HILIC-MS的分析。 TSKgel FcR-IIIA-5PW 是一种半制备型亲和色谱柱，其固定相是将重组FcyRMIA 配基，键合到10 um 粒径的多孔聚甲基丙烯酸酯聚合物基质上，上样量最高可达 5 mg mAb。它与分析柱 (TSKgelFcR-IIA-NPR)不同，分析柱采用的是无孔填料基质，上样量通常≤50ug mAb。因此，使用半制备型 TSKgel FcR-IIA-5PW色谱柱，单次可收集更多的样品，对这一工作流程大有裨益(图1)。 该半制备型色谱柱的附加效用是可以通过收集足量的样品，通过酶促聚糖释放和 HILIC-MS 方法对 mAb 糖型进行深度分析。 图1.分析释放聚糖的新工作流程 材料与方法： TSKgel FcR-IIIA 条件 色谱柱： TSKgel FcR-IIIA-5PW (10 um， 7.8 mm ID ×7.5 cm) 流动云： A： 50 mmol/L 柠檬酸盐/NaOH (pH6.0) B： 50mmol/L 柠檬酸盐/NaOH(pH 4.0) 方法： 平衡：5 CVMP A清洗：4CV25%MPB洗脱：线性梯度25-90% B， 14 CV 以上在90%B 和100%B下保持4CV 流速：平衡、进液和清洗步骤： 0.5mL/min 洗脱和保持步骤： 0.25mL/min 设备： AKTATM avant 25 FPLC 检测器： UV@ 280 nm 度：室温 样品： 5 mg Protein A 纯化后的曲妥珠单抗(Herceptin 生物仿制药) HILIC-MS条件 色谱柱： TSKgel Amide-80 (2 um， 2.1 mm ID×15 cm) 流动相： A： 50 mmol/L甲酸铵 (pH4.4) B： 100%乙腈 梯 度：35分钟内从65-58%B 流速：0.2mL/min 设备： Shimadzu Nexera@ XR UHPLC检测器：荧光： Ex265 nm， Em 425 nmMS： SCIEX X500B Q-TOF，ESI 阳性，m/z 200-3500 温度：50℃ 样品：载入样品5uL， 收集样品 10uL FcR 色谱柱的洗脱峰 MS条件 气体源1 60 psi 喷雾电压 5000V 气体源2 60 psi 去簇电压 20+0V 气帘气 45 psi 碰撞能量 7+0V CAD气体 7 psi 源温度 450℃ 积累时间 0.5 sec 合计时间段 4 图2所示为使用 TSKgel FcR-IIIA-5PW半制备型色谱柱分析Protein A 纯化后的曲妥珠单抗的色谱图。该峰轮廓与 TSKgelFcR-IIIA-NPR分析本(本文中未显示)相当，随着 pH 值的降低，首先显示的是低亲和力，其后依次是中亲和力和高亲和力组分。我们从收集的峰1、2和3中释放并标记了聚糖，然后将其进样到与 MS 相连的 TSKgel Amide-80 HILIC 色谱柱中对聚糖进行定量分析。 图2. Herceptin 生物仿制药在 TSKgel FcR-IIIA-5PW 上的洗脱曲线(上图)以及 HILIC-MS 分析 FcR 组分释放的聚糖时的相对强度(下图) 如图3所示， TSKgel Amide-80 色谱柱与质谱联用表明，与FcyRIIIA配基(峰3)亲和力最高的 mAb 糖型，其N-聚糖结构(G1F 和 G2F 聚糖符号)中半乳糖的含量也最高。峰2相对于峰1显示出了更高的G1F 水平，峰1含有更丰富的岩藻糖基化聚糖，不含末端半乳糖 (G0F)。 图3. HILIC-MS： TSKgel FcR-IIIA-5PW 色谱柱收集的组分中3个峰内6种不同N-聚糖的相对丰度 结论 半制备型 TSKgel FcR-IIIA 亲和色谱分离和 HILIC分析，组成了一个两步工作流程，可快速筛选上下游的 mAb 产品。利用HILIC-MS可以确认不同 mAb 糖型中N-聚糖的有无及其相对数量，从而对 mAb 进行深度表征。此类分析几乎可在任何质谱仪上进行，无需高分辨率设备。在正交色谱方法中使用相同样品材料的额外好处是，为药物开发和质量控制创造了全新优势。该工作流程的优势还包括，无需进行昂贵且费时费力的生物活性测定，就能够监测到 FcyRIIIA的亲和力及其相对 ADCC 活性。 TSKgel 和 Tosoh Bioscience 是 Tosoh Corporation 的注册商标。 ( AKT A 是 GE H e althcare Bio-Sciences 的商 标。 ) ( H e rcepti n 是 Genentech， Inc.的注册 商 标 ) ( Nexera 是 Shimadzu Corporati o n 的 注 册 商 标。 ) 单克隆抗体是一类重要的治疗药物，拥有治疗多种疾病的巨大潜力。由于其结构具有高度复杂性和聚糖异质性，因此必须对其关键质量属性进行表征和严格控制，才能保证药物的质量和功效。与Fc区Asn-297糖基化位点相连的mAb聚糖会影响生物活性，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和稳定性。TSKgel FcR-IIIA系列色谱柱根据单克隆抗体对FcγRIIIA配体的亲和力，将其分为3个组分：低亲和力、中亲和力和高亲和力。这主要取决于mAb的糖型及其ADCC活性。为了定量和阐明基于FcRIIIA亲和力分离的不同组分糖型聚糖谱，需要首先对馏分中的抗体聚糖进行释放并标记，再使用HILIC-MS 的分析。TSKgel FcR-IIIA-5PW是一种半制备型亲和色谱柱，其固定相是将重组FcγRIIIA 配基，键合到10 μm粒径的多孔聚甲基丙烯酸酯聚合物基质上，上样量最高可达5 mg mAb。它与分析柱 (TSKgel FcRIIIA-NPR) 不同，分析柱采用的是无孔填料基质，上样量通常 ≤50μg mAb。因此，使用半制备型TSKgel FcR-IIIA-5PW色谱柱，单次可收集更多的样品，对这一工作流程大有裨益。该半制备型色谱柱的附加效用是可以通过收集足量的样品，通过酶促聚糖释放和HILIC-MS方法对mAb糖型进行深度分析。‍