环境空气中voc检测方案

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MARKESinternational发布日期：2021年7月 第2页 应用案例154 优化吸附管采样和 TD-GC-MS的分析性能来指导疾病诊断的呼吸气和生物监测 摘要 本应用案例旨在为从事呼吸气监测常规分析或研究的疾病诊断人员提供有关如何优化热脱附 (TD)分析性能的指导。本文总结了采样和实验室工作流程中的主要步骤，明确了主要的分析挑战，并就相关的特征和参数范围给出了建议。 引言 挥发性有机物(VOCs)是人体许多代谢过程的副产物，有针对性地分析呼出气体中的特定 VOC，采用非侵入性方式诊断各种危及生命的疾病成为可能。虽然人们早就知道呼吸气体呈现烂苹果味，可能与早期的糖尿病有关，而刺鼻的氨味则可能是肾衰竭的迹象。最新研究表明，分析呼吸末气中痕量 VOCs 的分布或分布模有有助于更多疾病的筛查，例如呼吸道和胃肠道疾病1、癌症2.3、肝病2.4以及炎症性肠病(IBD)等。5 如果这一技术能够应用于临床，通过呼吸气的分析能够实现大量人群的经济高效的非侵入性筛查，促进早期诊断，改善患者检测产出并降低医疗成本。 优化呼吸气体中痕量 VOC 的采样和分析工作流程 热解吸气相色谱质谱联用法(TD-GC-MS)-这项技术被誉为呼吸气中 VOCs分析的“黄金法则"，用于识别复杂和可变人体呼吸谱中痕量 VOC 生物标志物。 呼吸气样品经由一系列呼吸气体收集装置(旨在收集肺部深处重要的呼吸末气体)被直接或间接地引入经老化的吸附管中。管中的吸附剂(单一或多种吸附剂)选择性地保留呼吸气样品中的 VOCs， 但不保留水和永久性气体。与其它保存方式相比，被吸附在样品管内的呼吸气中的 VOCs 更稳定且容易保存，在吸附管妥善密封的前提下，大多数相关化合物可保存数周乃至数月。采集一批呼吸气样品带回实验室后，实验人员会将样品管加载到经过过准的 TD-GC-MS系统上，同时需要加载空白样和标样，以备系统的自动运行和出具分析报告。 呼吸气采样和分析工作流程的主要步骤详见下文图1。 第1~4阶段：准备用于呼吸气样品收集的吸附管 关键步骤包括： ·吸附管的选择： TD采样管采用玻璃、不锈钢或惰性涂层不锈钢等材质制成，管内填充一种、两种或三种吸附剂。吸附管的选择取决于当前项目的具体要求。例如，许多处于研究或“生物标志物探索”阶段的呼吸气监测项目均采用 Markes 的惰性“生物监测”专用脱管管，该管中装填有两种疏水性吸附剂，能富集非常广泛的挥发性有机物。但是，大多数常规的呼吸气筛查仅针对少数已鉴别的生物标志物，因此为更好地开展工作，人们通常选择更易快速老化的、具有高成本效益的单一吸附剂的样品管。无论选择哪种吸附剂组成(一种吸附剂或多种吸附剂组合方式)的吸附管，原则是能定量保留既定样品体积中的一切相关化合物而不出现穿透。要测试吸附管是否穿透，可以在采集呼吸气样品时串联两个样品管，完成采样后，查验第二根样品管上是否有与第一根样品管中相同的目标化合物。如果在第二个采样管上检测到了一种或多种目标化合物，则说明发生了穿透。有关吸附管和吸附剂选择的更多信息，请参阅应用案例005和应用案例027。另外，现行的多个 TD 标准方法中也提供了详细指导，例如 ISO 16000-6、EN ISO 16017-1 和 ASTM D6196。 ( 注意：鉴于呼吸样品通常湿度较高，除特殊情况外，不建议使用非疏水性吸附剂。 ) ·老化：所有吸附管都存在固有杂质峰，必须在样品采集前通过彻底地老化将其最小化。这一点对于呼吸监测而言尤为重要，因为呼吸气体中相关化合物的含量通常很低(含量水平为 ppb 级及以下)。与固有观念相反，其实新管或重新装填吸附剂的吸附管往往杂质峰现象最为严重。通常使用管老化仪(如 Markes TC-20TM) 离线老化采样管。活化过程是在加热的吸附管中通入与采样方向相反的惰性气体，而且设定的温度和流速通常高于分析时所用的温度和流速。对于 Tenax@ TA 和 Markes"生物监测”专用吸附管，最常用的流速和温度分别为 100 mL/min 和 300~330°C。在任何情况下，必须注意遵循采样管生产商的技术指南，勿超过管中吸附剂耐受温度的限值。对于新充填了吸附剂的吸附管，老化过程可能需要数小时，但对于用过且干净的吸附管则仅需10~15分钟。 ·检查空白水平：在完成老化步骤后，从老化的采样管批次中随机抽取几根样品管检查老化的效果，具体的方法为：在常规分析条件下，将这些样品管上样至经校准且洁净的TD-GC-MS 系统上进行分析。如果单个杂质峰低于 ng水平，或不干扰任何最低相关浓度的目标化合物，则空白水平可接受。 ·密封和储存经验证的洁净采样管：经过老化并验证合格的样品管应安装长期储存管帽，防止在储存和运输过程中空气中的污染物进入采样管。通常将老化后且加盖管帽的采样管置于洁净、气密且没有任何释放的容器中用于储存和运输(见图2和应用案例019)。 。至少留出三根采样管用作现场空白。 ·为便于验证分析系统空白和进行系统校准，实验室应保留更多经老化且验证的吸附管。 呼吸气体样品采集装置的类型 用于采集呼吸气并转移至吸附管的采样装置和步骤有多种类型。此处以 Markes BioVOC-2TM 为例，该装置可实现将一份或多份肺泡中(呼吸末气)的气体样品直接转移至吸附管上，而无需任何中间转移过程(如转移至气袋或采样罐)。此举最大限度地降低了污染风险，并为临床工作人员提供了快速且直接的采样流程(图3)。关于其他的呼吸气体样品收集装置的描述可参阅参考资料。6.7呼吸气体采样器的选择最终取决于具体的研究目标。 图2：运输容器中已安装管帽的采样管。 选择采样位置 第5~8阶段：呼吸气体样品收集最重要和最需要考虑因素包括： 呼吸气体样品收集的诊所或监测场所应通风良好，需保证室内空气质量且附近无明显的挥发性有机物贡献源。 所需老化后的采样管的数量 优化采样程序 各呼吸气体采样所需经老化采样管的数量与以下因素相关： ·从所有患者及对照组中收集样品所需的采样管数量(包括任何所需的重复样)。 ·用于在各诊所或采样场所采集代表性环境空气样品的采样管至少三根。 收集呼吸气体样品前，需记录每个采样管的唯一识别号以及相关的患者信息。同时，还可通过扫描并记录采样管的条形码或可选电子标签，来消除转录错误的风险。然后，使用 CapLokTM 工具(图4)从采样管的各端取下长期储存管帽，将管帽的一侧置于洁净表面。根据所选呼吸气体收集装置的类型，在收集患者呼吸气体时，吸附管从带凹槽(采样端)抽取呼吸气体样品。注意：用于呼吸采样的疏水性吸附剂不会保留无机气体和呼吸湿气，因此可最大限度地减少后续分析过程中的干扰。通常，呼吸气体样品的采样体积范围为100 mL 至2L. 图4：用于移除管帽的 CapLok工具(请观看“使用说明"视频)。 图3： (1) BioVOC-2组件-带盖的罐身、带尖端的推杆、塞子、一次性 纸板吹嘴和止逆阀；(2)样品采集；(3)吸附管的采样端连接到 BioVOC-2主体的前端；(4)推动推杆以将样品转移至吸附管中。 ( 电话：+ 4 4(0)1443230935传真：+4 4 (0)1443231531电子邮箱： enqu i ries@markes.com ) 呼吸气样品被转移至吸附管后，采样管两端的长期保存密封管帽应快速拧紧。并将其放入运输/储存容器中(参照上文针对空白管的描述)，以尽量避免环境空气中污染物的进入。然后，将密封后的采样管放入储存/运输容器内并(在环境或冷藏条件下)保存在洁净的环境中，以待分析。 注意：如果在冷藏条件下储存采样管，在样品达到其最低温度后，将需要使用适当的工具重新拧紧长期储存管帽，以避免松动。 空白和室内空气样品 从老化后的批次中随机选择至少三根采样管作为现场空白。然后，将这些现场空白连同采样管一起运至诊所，在采样场所移除采样管的储存管帽，但不做任何采样操作，然后在采样结束后重新为现场空白安装管帽并将其同采样管一起运回。在各监测位置，还需至少三根随机选择的经老化的采样管来收集采样点的室内空气样品。空气量应与收集的呼吸气体量相匹配。此时，需要在吸附管上连接一个采样泵来采集空气样品，样品管的安装应注意管上的箭头标识，带凹槽的一端为采样端。所选呼吸气体采样器本身也适用于室内空气采样的情况(如Markes BioVOC-2)。采样结束后，应将密封好的空白管和室内空气采样管以及呼吸气采样管存储在同一可密封运输容器中。 第9和10阶段：实验室准备和样品分析 选择最佳系统配置以满足研究要求 对于此类分析，有多种商用TD、GC/GCxGC质谱联用仪系统可供选择，其中每种系统都有其各自的优势和局限性。具体的选择在很大程度上取决于预期的样品数量以及呼吸监测工作所计划的阶段：例如是研究(生物标志物探索)，还是有限的目标生物标志物的常规分析。有关更多信息，请参阅科学文献中的建议。 在分析一批呼吸气样品前，应对分析系统进行检查、调谐，并确认系统运行符合生产商的质量标准。 热脱附方法开发 热脱附条件根据吸附管的选择以及目标化合物的发性而有所不同，一般而言，应将脱附和流路温度尽可能保持在适中的水平，在不影响分析物回收率的情况下将本底水平降至最低。呼吸气中 VOCs分析所需的脱附温度高于250°℃的情况十分罕见。 有关开发和优化 TD 方法的更多信息，请参阅应用案例021。 使用 Markes 多种吸附剂组合的“生物监测”专用吸附管(部件号：C2-CAXX-5149)采样后，在 Markes TD100-xrTM自动热脱附仪上进行分析的典型脱附条件如下： 管解吸温度和时间： 250°C， 8 min (30 mL/min 流速) TD阀和流路温度： 125°C聚焦冷阱： "物质排放"(U-T12ME-2S)，低温+25°C， 以最大加热速率加热至280°C并保持 3 min冷阱脱附的气体流速： 5 mL/min (总体)~3.5 mL/min(至分流)以及1.5 mL/min(至色谱柱) 对于装填单一吸附剂(如Tenax)的样品管，用于常规生物监测的呼吸气体样品采集的典型的脱附条件为： 管解吸温度和时间： 250°C， 8 min (30 mL/min流速)TD 阀和流路温度： 125°C聚焦冷阱： Tenax， 低温-30°C， 以最大加热速率加热至280°℃并保持 3 min冷阱脱附的气体流速： 5mL/min (总流速)~3.5 mL/min(至分流)以及 1.5 mL/min(至色谱柱) 验证分析系统的洁净度 在进行样品分析前，应老化整套 TD-GC-MS分析系统，并检查是否存在杂质峰。系统老化通常需要比分析条件更严格的流量和温度条件。然后，在常规分析条件下考察空管空白和吸附管空白，以检查系统的本底水平。如果不影响目标化合物的最低目标浓度，则认认系统本底水平可接受。 在上述条件下脱附的空管中的单个杂质峰应 ≤1ng， 而经过严格老化的吸附管中的单个杂质峰应≤2ng。典型的空白色谱图见图5(例如吸附管)。 校准 完成分析系统的空白验证后，使用经老化的吸附管加载多个浓度水平的目标化合物， (通常为五个)对系统进行校准，以便涵盖拟从患者身上收集的各分析物的质量范围。更多有关热脱附系统校准的建议，请参阅应用案例 007。同时，还应利用老化后的吸附管制备一系列中等浓度水平的目标化合物标准品，具体的制备数量应保证足以在自动分析序列中穿插于样品和空白之间；例如，按每10个样品后需要加入一个标准品。 图5： (上图)使用填充有 150 mg Tenax TA 的经严格清洁玻璃管时，在上述条件下运行 TD-GC-MS空白。(下图)使用经严格清洁的 Silcosteel@生物监测管时，在上述条件下运行 TD-GC-MS空白。 分析 在分析前，对于储存在冷藏条件下的样品管、空白管，要将其放置在室温条件下，待其温度与室温一致后才能将其从储存/运输容器中移出并打开管帽(否则实验室空气中的湿气会在冷管中凝结，造成干扰和误差)。从各管上取下长期储存管帽后，必须马上再盖上分析管帽，尽可能缩短样品管暴露于实验室空气中的时间。然后，可将样品管上样至自动热脱附仪(如适用)中，并穿插上空白和单一浓度水平的校准管。分析管帽有助于维持吸附管的完整性，可在自动 TD-GC-MS分析前后保护吸附管，避免分析物流失和杂质侵入。 将各样品管依次上样至热脱附仪对样品管执行严格的泄漏测试(按照标准方法的要求-参见应用案例003)，然后在惰性载气流中加热以释放收集到的 VOC， 并将其转移到热脱附系统内装填有吸附剂窄径电子制冷聚焦冷阱中。聚焦阱有选择地浓缩有机蒸汽，同时排出残留的痕量水。在吸附管的一阶脱附结束时，聚焦阱在反向载气流中迅速被加热(加热速率为100°C/s)，以释放富集的化合物并将其通过狭长的聚焦 管脱附和入口分流： 样品管和冷阱中可含有多种 图6：二阶热脱附示意图。 冷阱转移至 GC毛细管色谱柱中，进而触而 GC-MS运行。二阶浓缩和热脱附过程(图6)可将VOC 有效注入至 GC 或GCxGC毛细管色谱柱中，防止扩散(即使分流流量很低或为零)，从而最大限度地提高灵敏度。 Markes 的先进TD 技术如何应对呼吸监测中的关键挑战 呼吸分析涉及的主要挑战与许多目标化合物的低浓度和呼吸气体分布的复杂性有关；例如，最近的一篇相关的综述中列举了800多种的 VOCs。8同时，不同个体的呼吸气体分布也存在显著差异，而且具体的分布还受包括饮食、年龄、性别、用药情况和运动频率在内的多种因素影响。例如，异戊二烯含量偏低是患肺癌的迹象，但与老年人相比，儿童和年轻人呼吸气体中的异戊二烯含量通常偏低。健康人群之间的这种自然差异使得确认生物标志物(用于 区分健康个体和患特定疾病个体的化合物或化合物组)变得更加困难。 其它因素也会使呼吸气的分析复杂化，例如在大型试验中收集的样品数量庞大、样品固有的高湿度、以及在同时分析一整批样品前常常需要长期储存样品等。 Markes 最新的 xr 系列自动热脱附系统包含多种先进 TD 技术，这些技术不仅可以轻松应对此类挑战，而且也能够满足呼吸分析领域泊应用需求。主要示例包括： 灵敏度 一般来说，热脱附克服了溶剂萃取法的稀释限制，将检出限降低了高达三个数量级。更重要的是，优化灵敏度是Markes TD 系统设计理念的主攻方向。在二阶热解吸过程中(图3)，整份呼吸气体样品被聚焦至一个低热质量聚焦阱上，然后被迅速加热(加热速率高达100°C/s)，这使得 图7：全扫描模式下的不分流呼吸气体样品 TD-GC-MS分析，图示己烷峰峰值为46 ng。 被富集的 VOC 被解吸，并随仅 100 uL 的载气注入至 GC 毛细管色谱柱中。考虑到聚焦阱脱附可在零分流或低分流下运行，因此对于大多数的呼吸气样品来说，均可实现约104的总浓缩系数，而不会产生任何溶剂或水干扰。大多数化合物的检出限均处于低 ppt量级，具体取决于所使用检测器或质谱仪的类型(图7)。 另一个影响灵敏度关键点是低系统本底，如上文所述和图5所示。良好的实验室操作对于可靠的呼吸气体采样至关重要，无论是对采样管老化/储存还是分析系统的良好管理而言均是如此。简言之，呼吸监测的关键原则是：使用大量空白并尽可能保持脱附温度适中。 独特的样品堆叠功能是 Markes TD 系统的另一大亮点，可进一步提高分析灵敏度(图8)。借助此项功能，可实现在脱附/注入 GC 前将多份呼吸气体样品组合(“堆叠”)至聚焦阱上。 图8：通过样品堆叠提高分析的灵敏度的图示，其中可将多个 吸附管依次上样并脱附至聚焦阱上，然后聚焦阱在一次进样中脱附至 GC-MS 中。 运行中样品堆叠的示例见图9.图中所示为单份呼吸气体样品(上图)与同一个体三个呼吸气体样品的堆叠样品(下图)相比较的情况。从堆叠样品中获得的增强信号能可靠地鉴别样品中存在的最低水平的化合物，包括甲基乙烯基酮和2-甲基呋喃。 有趣的是，另一个(已突出显示)仅在堆叠分析中可见的峰被初步鉴别为乙酸乙酯(匹配因子为735)，它是幽门螺杆菌感染的潜在生物标志物。1这种细菌性胃感染可能导致胃癌。 更广的分析物范围 Markes 的 TD 系统在化合物分析范围方面具有多功能性，可在单次运行中分析其中多种化合物。这主要得益于专利技术 图9：单管呼吸气体样品分析与使用三管样品的样品堆叠对比图。三管响应增强表明可检测到其他峰。利用质谱库初步鉴别了乙酸乙酯，而且61 m/z 的EIC 证实了该峰的存在。 的小体积加热阀，此阀使聚焦阱的反吹(逆流)脱附更容易实现(图6)。反吹脱附意味着高沸点的半挥发性化合物被保留并能够从聚焦阱的入口/出口端有效释放，而不会与聚焦阱尾端用于保留最易挥发化合物的更强吸附剂接触。此阀结构紧凑且具有惰性，并且其运行温度范围广，可实现在一个 TD 系统中对高沸点半挥发性化合物和热不稳定硫化合物进行定量回收。 出色的样品保护并提供可靠的结果 Markes TD技术的多项优势相结合可有效保护样品并确保结果可靠。其中最重要的一项一势在于 DiffLokTM分析管帽，此管帽可用于密封带自动进样器的 Markes TD的管系统(图10)。 对于自动热脱附而言分析管帽必不可少；如果没有分析管帽，吸附管将暴露在实验室环境中，这容易造成(杂质)污染和所保留化合物的损失。但是，大多数品牌的 TD 均需要复杂的机械结构来自动移除和更换分析管帽，这又增加了分析序列失败的风险。 Markes 的 DiffLok 管帽采用扩散锁定专利技术，可在自动分析前后保护吸附管的同时允许气体在脱附过程中流经吸附管而无需移除或更换管帽。这一设计不仅可以保护样品和脱附管，同时还可以使自动化操作简单化。欲了解更多信息，请参阅应用案例061。 泄漏测试 Markes 热脱附仪在分析前会对每个样品进行加压、环境温度和无气流的泄漏测试。这一措施可有效保证样品的完整性，而且对于获得可靠的结果和满足热脱附标准方法而言至 图10：Markes 的 DiffLok 分析管帽，采用扩散锁定的专利技术，用于在自动 TD-GC (-MS)分析过程中保持样品的完整性，而无需移除或更换管帽。 关重要。如果泄漏测试失败，分析序列会移至下一样品，确保生产率并保持样品的完整性。同时，系统会记录测试失败的样品管，以便分析人员检查管/管帽情况，并在分析序列结束时重新运行样品。 样品储存 大规模临床试验所需要的运行时间周期往往较长，因此研究人员通常希望将特殊批次测试的样品管储存起来，直到可以一起分析所有样品。当然，这一想法并非天方夜谭，因为在按照上文所述进行加盖密封和储存的前提下，化学性质稳定的有机化合物可在吸附管中储存数月乃至数年。这与储存在 ( M arkes International Ltd ) 采样袋中的呼吸气体样品形成鲜明对比，因为后者仅可保持稳定几个小时。 用于重复分析的定量再收集 内标 (IS) 添加 IS 添加广泛用于 GC 应用的分析质量控制。在 TD应用中，这通常涉及：在样品收集前或即将脱附时，将精确等分的气体标准品自动引入到吸附管的采样端或聚焦冷阱。样品中不应存在内标。常用的化合物包括气代甲苯或气代苯。 每份样品都是特定时间点个体呼吸气体分布的独特写照。所有 Markes 热脱附仪，甚至是手动系统，均可在分析过程中定量再收集任何分流，便于样品备份、重复分析以及结果的确认和验证。这这破了传统 TD 系统的“单次采样”限制，对于呼吸监测和其他难以或无法重复使用样品的 TD 应用而言均具有宝贵的价值。 通过在采样前向老化过的采样管添加标准品，可核实整个运输、采样、储存和分析周期。在即将脱附时将标准品添加到已采样管或聚焦阱中，能检查分析系统的性能。可使用两种不同的 IS 化合物实现相应的检查。 重复分析的定量再收集的另一个另势是“高-低(Hi-Lo) 兼顾"的技术。 "高-低 (Hi-Lo) 兼分"的分析技术，顾名思义，即可以首先使用相对较高的分流比(例如20：1)运行未表征样品，检测不会让系统过载的主要组分。然后可以使用更低的分流比或完全不分流重新分析经再收集所得样品，进一步测定并鉴别痕量化合物(图12)。 在下文的示例中，在样品收集前对经老化的采样管预先添加了气代苯(苯-d)，而在即将脱附时自动向采样管的采样端添加了气代甲苯(甲苯-d)。两份样品的结果如图11所示两者显示出了对甲苯-d的一致响应(峰值出现在2.4分钟时)，这表明分析系统运行正常。但是，样品2中未检出苯-d，这表明该管的采样或密封流程存在问题。在这种情况下，样品2的结果将被舍弃。 图11：色谱图证明了在采样和运输过程中苯-d损失时，添加内标物对质量控制的重要性。如果没有添加内标， 图12：初始分析使用 20：1的分流有利于检出丙酮等含量较高的化合物。重复分析使用仅2：1的分流可实现对初始运行中 未检测出的右旋柠檬烯的分析。 自动化能力和多功能性 为应对大规模呼吸监测研究中样品数量庞大这一挑战，Markes 扩大了现有TD 自动采样器的样品分析范围，并提升了分析能力。除了可满足100根样品管的 TD100-xr外，Markes International 还提供其目自动化 TD 平台： 磁 TD100-xr ILTRA-xr 图13： Markes 提供的一系列自动热脱附平台。左上： TD100-xr； 右上： Centri；中间： UNITY-ULTRA-xr Pro； 下方： UNITY-ULTRA-CIA Advantage-xr。 ( · Centri@-提供50位样品管自动化热脱附，以及针对唾液或 血液等体液的自动提取和富集技术(顶空-富集； SPME-富集和吸附提取)， ) ( ·UNITY-ULTRA-xr ProTM-可一次处理最多199份吸附管样品。 ) · UNITY-ULTRA-CIA Advantage-xrTM-可在单个序列中实现对气袋采集的样品及吸附管采集的样品的自动分析。 所有这些系统(图13)均广泛用于呼吸监测(见参考文献)。 强大的多功能水汽管理 呼吸气体中包含了大量水蒸气，如果在样品脱附前或脱附时未选择性地将其去除，会干扰 TD-GC-MS分析结果。使用非疏水性吸附剂收集并未经水汽管理即进行脱附的呼吸气样品进行分析的情况如图14所示。其中，水峰持续超过8分钟，抑制了共洗脱目标化合物(如乙醇和异戊二烯等)的响应. 即使按照建议使用疏水性吸附剂收集呼吸气体样品，也经常会有残留的水分，因此需要在分析前使用干吹功能将水汽选择性去除。在环境温度下使干燥、超洁净的惰性气体(He或N，)沿采样方向流经样品管，将水从管后端从针阀排出。这一操作既可以作为自动化热脱附流程的一部分，也可以使用 TC-20 老化仪对多个样品管同时进行除水，优势显而易见，如图14所示。 图14：气相色谱图突出显示了干吹扫可有效去除样品中的水分。 Markes TD 技术与 GC-MS 为诊断性呼吸监测提供了强大的多功能分析解决方案-既满足常规监测应用，也满足与呼吸气中 VOCs 分析的相关其它研究领域。但是，呼吸气监测这一应用仍然存在诸多挑战，在开发和优化采样及分析参数时必须考虑到多个方面。 ( 本篇应用案例重点介绍了其中最重要的挑战，并就如何以最佳方式应对这些挑战提供了指导，从而有助于实现高效、可靠的工作流程，并提高诊断性呼吸监测的实用性。 ) ( 参考文献 ) ( 1 . 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