核酸药物分析用TSKgel色谱柱的选型及应用案例

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核酸药物因兼具基因修饰和传统药物的双重特点，近年来逐渐成为精准生物医学和疾病治疗的热点。作为主流核酸药物的合成寡核苷酸，在经过化学合成后会产生位置异构体及其他工艺相关杂质，这些杂质的分析和结构表征同等重要。液相色谱技术具有样品适用范围广、分离效率高、速度快等特点，已成为药物生产与质控分析必不可少的重要手段。东曹公司一直专注于生命科学领域相关液相色谱填料及色谱柱产品的研发与生产。本资料汇总了寡核苷酸/质粒分析时常用的色谱分离模式及适用的TSKgel色谱柱型号和应用实例。TSKgel 寡核苷酸·质粒的HPLC分析 TSKgel°色谱柱选型及应用案例- 寡核苷酸的HPLC分析方法 治疗性寡核苷酸是由固相化学合成工艺生产。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包 含许多目标产物的类似物(分子量的差别：碱基数 N-1、N、N+1 等)，磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质 的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。液相色谱技术具有样品适用范围广、分离效率高、速度快等特点，已成为 核酸药物生产与质控分析必不可少的重要手段。 图 1.寡核苷酸的磷酸化及糖基修饰 磷酸化修饰：空 间 配置引起的异构体(但都是有效成分) 糖基修饰：通过架桥增强对核酸酶的耐受和降低毒性(如吗啉环型) 碱基修饰：适配体立体构造的多样性 表1.寡核苷酸分离常用的 HPLC分离模式及适用的 TSKgel 色谱柱 分离模式 分离原理 特长及用途 适用的色谱柱 ·可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行分离 ·基于碱基数不同分离(Mw) TSKgel UP-SW系列 尺寸排阻色谱 (SEC) 分析物的分子尺寸大小 TSKgel SWxL系列 TSKgel PWxL系列 ·用于质量控制或纯度含量分析 TSKgel G-DNA-PW 离子交换色谱(IEC) 分析物与固定相间的 ·样品载量高 TSKgel DNA-NPR 离子相互作用 ·可以根据磷酸基的数量分离样品(N-1，N，N+1) TSKgel DNA-STAT TSKgel OligoDNA-RP 反相色谱 (RPC) 分析物与填料间疏水性 ·分辨率高 TSKgel ODS-100V 相互作用 ·结构异构体、不对称体的分离 TSKgel Super-ODS ·增强 HILIC-ESI-MS 质谱检测灵敏度(不加离子对试剂条件下) ·结构异构体、不对称体的分离 亲水作用色谱(HILIC) 分析物与填料间亲水性 TSKgel Amide 80 2 pm 相互作用 应用实例 图1.超高效SEC色谱柱分离N及N-1穿核苷酸 保留 时 间(分钟) 色 谱柱： TS K g e l UP -S W2000 (2 p m ， 4.6 mm ID×30cm×2) 流动相： 50mmo l /L 磷酸盐缓冲溶液(pH 6.7)+300 mmo l /L N aCI +0.03%N aNs 流 速 ： 0.2mL /m in 检测： U V @260nm 样 品 ： 19-m er (5'-AATT C A T CGGT T C AGAGA C -3)& 20-mer (5-GAA T TCATCGG TT CAGAGAC-3) o 串联两根 30cm 柱长的 T S Kge l UP -S W 2000 色 谱柱分析两种相 差 一个碱 基 的寡核苷酸混合物。 图3.合成寡核苷酸的 SEC分析 色谱柱： T SKg el G 2000SWx. (7.8 mmI.D .x30 cm) 流动相： 0.1molL磷酸盐缓冲液+0.3 mol/L N aCI (pH7.0) +1 mmol/L EDT A 流 速：0.125mL/min 检 测： UV(260nm)温 度：25℃样 品：合成赛核苷酸(15，20，25，30，35 mer) 图2.流动相添加有机溶剂对硫代寡聚核苷酸SEC分析的影响 色 谱 柱： TSKge l G2000SWx. (7.8 m m l .D.x30 c m) 流动 相：乙腈 /20 mmoVL 磷 酸 盐 缓 冲液+0.3 mo l /L N aC I (p H7.0)=(a )0/100. (b) 10/90. (c) 20/80. (d ) 30/70 通 速： 1.0mL/min 度：25℃ 检测：260nm 进 样量： 10p L 样品：20mer的寡 聚 核苷 酸及S 代 寡聚核 苷 酸 ， 1 p m ol /L 添加20%的 乙 睛 会 抑制硫代寡聚核 苷 酸与固 定 相间的疏水 相互 作用 。 图4.脂质体包被的 siRNA 的 SEC分离 色谱柱： TSK g e l Sup erS W 2000 (4.6 mm I .D .x 30 cm)×2流动 相 ： PBS (pH 4.0)流 速： 0.4m L/min 检测：UV 温 度：25℃ Re f .； H and b ook o f a nalys is of ol igon u c l e ot i des and r ela t ed Prod uc ts，Feb. 23 (2011) 125. E d i t e d by J. V. Bo nil l a et a l.. 图5.同链长的4种寡聚核酸的AIEC分离 色 谱 柱： (a ) T SKgel DN A -N P R (4.6mm I .D .*7.5 c m ) 样 品： 1. TCCTAGCGAACTTGCATCGA (b)TSKgel DNA-STAT ( 4.6mm I .D.x10 cm)流 动相： (A)20 mmol /L Tris -HCI缓冲液(p H8.5)(B) 20 m m ol /L Tr i s -HCI缓冲液 +1 mol/L NaCI (pH 8.5)梯 度：(a)线性梯度 28%B -48%B(60 mi n )(b)线性梯度40%B→65 % B(60 m in )流 速 ：0.5mL /mi n 2. TCTCTACATGATAATGTCCT 3. CGTAACTATAACGGTCCTAA 4. T AAAT T CCGTCCCGCTTGAA 温 度：25℃ 检 测 ：260nm ◎色谱柱 官 能团的不同 、色谱柱长的 不同。不同色谱柱的 选 择性也不同 。白 同链长的 核酸 也 可以 分 离(根据构 造 和 疏 水性的差 异)。 图6.硫代寡聚核苷酸的AIEC 分离 图7.精纯后硫代寡聚核苷酸各组分的AIEC 分析 Retention time Iminutes) 色谱 柱： TSKge l DNA -NPR (4.6 mm1.Dx7.5cm) 流动相： A：20mm ol /L NaOH(pH 12)+10 mmolL NaBr+1%二 乙 胺 B： 20 mm o l /L NaOH (pH 12)+1 mol /L N aBr +1%二乙 胺 梯 度 ： 3.5 mi n (20% B).12 mi n (20%B)，45 min (55% B) 流速： 1.0m L/min 检测 ： U V(260n m ) 温度：60℃(自 动进 样：4C ) 样品：粗 合 成 寡核 苷酸(13 me r ， 脱保护 ) B -提纯后 的寡核 苷酸溶液 初提纯度 ：67% 图10.单、双链siRNA 的 AIEC分离 色 谱 柱 ： T SKgel S uperQ-5PW (7.5 mmI .D.x7.5 cm ) 流动相： A： 20 mM P B，pH6.8B： 20 mM P B， 1M Na Cl， p H 6.8 度 ： A →B， 30 m in 速：1m l/min 度：1m g/ml 进 样量 ：4p L 温 度：室温 检测： UV260nm 色谱柱 ： TSKgel DEAE -2SW (5 pm，4.6 mm I Dx25cm ) 流动 相： A：50mm o l /L 乙 酸 铵 B： 1.5 m ol /L 乙 酸铵 弟 度 ：流动相 B：0→100%(60分 钟内) 流 速 ： 1m L /m i n 检 测 ：U V (254nm) 温 显度 ：25℃ 样 品：1.2碱 基硫 代 磷酸寡核 苷 酸 2.3碱 基硫代磷 酸寡核 苷 酸 3.4碱基硫 代 磷酸核苷酸 4.5碱基 硫代 磷 酸 寡核 苷 酸 图12.单、双链 siRNA 的 SEC分离 图13.流动相成分对坊聚核苷酸分析结果的影响 色 谱 柱： T SKge l Ol i go -DN A RP (4.6m ml.D.x15 cm ) 流 动 相 ：(A)乙腈/缓 冲 液(p H 7.0)=5/95 (B)乙 腈/缓 冲液(p H 7.0)=25/75 梯 度：线性 梯度A →B (90mi n) 缓 冲 液： (a)25 m m o l/L 醋酸铵缓 冲液 (b ) 50 mmo l/L 醋 酸 铵 缓冲 液 (c ) 100 mm ol /L 醋 酸铵缓 冲液 (d) 100 m m ol /L 磷酸 盐缓冲 液 (e ) 100 mmol /L 醋酸三乙 胺缓冲 液 流 速： 1.0mL/m in 检 测 ：260nm 进样量 ：20pL 样 品： oligode ox y ade nyl i c aci d， p (dA ) 16，20 图14.分离纯化后的寡聚核苷酸 图16. HILIC-MS分离寡核苷酸 图15.寡聚核苷酸的分离 色 谱 柱： T S K g el S upe r-ODS (4.6 mm l .D .x10 cm)流动相： (A)20mM P .B.+5mM T BAP (pH6.0) 梯 流 速： 1.5mL /min 检 测：260nm 样 品 ： oligodeo x yadenyl i c a c id，p (d A)12.18 (B )乙腈 度 ： (A ) l inea r， 32-49% ACN i n 5 m i nut es (B) l in ear， 20-40% AC N i n 10 mi nu t e s 质粒的HPLC分析方法 随着基因治疗和DNA疫苗的迅速发展，高纯度的质粒DNA的需求量越来越大。药物级质粒DNA必须要符合宿主 相关杂质、均一性方面的要求。因此，在质粒纯度检测时，需要区分出超螺旋、开环和线型三种拓扑异构体质粒。 表2.质粒分离常用的 H PLC 分离模式及适用的 TS K gel 色谱柱 分离模式 分离原理 特长及用途 适用的色谱柱 尺寸排阻色谱 (SEC) 分子尺寸大小 ·用于质量控制或纯度含量分析 TSKgel G6000PWxL TSKgel G-DNA-PW (质粒分子较大，在排阻VO附近洗脱) 离子交换色谱 (IEC) 电荷的差异 ·分离质粒拓扑异构体 TSKgel DNA-NPR 疏水色谱(HIC) 疏水性的差异 ·分离质粒拓扑异构体 TSKgel Butyl-NPR 应用实例 图 17. AIEC 分离质粒载体 图 18. pBR322 质粒粗样的分离 色谱柱 ： TSKge l DNA-NPR (2.5 pm， 4.6 mm I D×7.5c m) 洗脱液：缓冲溶液A： 20 mmol/L Tris-HCI (pH 9.0) 缓冲溶液B：含有1 mo l/L NaCI 的 缓冲溶液A 缓冲溶液B ： 从50%到65%的10 CV 的 线性梯度 流速 ：1mL/m in 检 测： U V (260nm) 样 品： PUC19质粒 色谱柱： TSKgel DEAE-5PW (10 pm，7.5 m m IDx 7.5cm )流动相： A： 25 mmol/LTr i s-HCI，1 m m o l/L EDTA， pH 8.0B： 25mmolLTris -HCI， 1 m mol/L EDTA， pH 8.0+1 m ol/L NaCI 梯 度： 流动 相 B从25一 60%(30分钟 内 )流 速： 1mL/min 检测 ： UV(260nm)度：25℃品： PBR322 质粒 样品载 量： 2.5 mg /1 mL 图19.快速分离质粒拓扑异构体 色谱柱： TSKge l DNA-NPR (2.5 pm， 4.6 mm I Dx7.5 c m ) 流动相： A： 20 mmol/L Tris /EDTA， pH 9.0B：A +1.0 mol /L 氯化钠 梯度： 5分钟内从50%B-65%B 流速： 1.0mL /min U HP L C系统： U ltimate 3000RS 检测： UV@260nm 温 度 ： 25℃ 进样量 ： 5pL 样品 ： P BR322 (NEBi ol abs ) o 3个洗脱峰代表 了 质粒 的 三种不同类 型：超螺旋、开环和线 型。其中 ，最 高峰 对 应超螺旋 质 粒。 色谱柱： TSKgel Bu t yI -NPR (2.5 pm， 4.6 m m I Dx 3.5c m) 洗脱液A： T ris -HCI -EDTA (pH 7.0) bu f fer containing ammonium sulfate (concent r a t io n m ay vary due t o size o f plasmid DNA) 洗脱液B ： T ri s-HCI-EDTA (pH 7.0) 梯 度：线性梯度(A →B) 流 速 ：0.5m L/min 检 测： UV(260n m) 样 品：质粒 Ref .； H . Schucchnig et al.， H PLC 2008， poste r 色谱柱 ： TSKgel G-DNA-PW+T SKgel G6000PWxL (7.8 mm I D*30 cm ×2) 洗脱液： 10 mmol/L Tri s -HCI (pH 8.0)，0.3 M NaCl，1 mM EDTA 柱温：室温 流速：0.4mL/min 检 测 ：U V(260nm) 样品 品：质粒 Ref .； 天然产物研 究与 开发Nat Pr o d Res D ev 2009，21：1003-1006. 尺寸排阻色谱柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 分离范围(碱基对) 23514 TSKgel UP-SW2000 2pm 4.6 mml.D.x30 cm <55 23448 TSKgel UP-SW3000 2pm 4.6 mml.D.x30 cm 55-110 23524 TSKgel UP-SW Aggregate 3pm 4.6 mml.D.x30 cm 110-375 8540 TSKgel G2000SWxL 5pm 7.8 mml.D.x30cm <55 8541 TSKgel G3000SWxL 5 pm 7.8 mml.D.x30 cm 55-110 8542 TSKgel G4000SWXL 8 pm 7.8 mml.D.x30 cm 110-375 8023 TSKgel G5000PWxL 10 pm 7.8 mml.D.x30 cm 375-1500 21875 TSKgel G6000PWxL-CP 10 pm 7.8 mml.D.x30 cm 1000-7000 8032 TSKgel G-DNA-PW 10pm 7.8mml.D.x30 cm 1000-7000 离子交换色谱柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 官能团 18249 TSKgel DNA-NPR 2.5 pm 4.6 mml.D.x7.5 cm DEAE 21962 TSKgel DNA-STAT 5 pm 4.6mml.D.x10 cm 季胺 18257 TSKgel SuperQ-5PW 10 pm 7.5mml.D.x7.5cm 三甲氨基 18387 TSKgel SuperQ-5PW 13 pm 21.5mml.D.x15 cm 三甲氨基 疏水色谱柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 官能团 14947 TSKgel ButyI-NPR 2.5pm 4.6mml.D.x3.5cm 丁基 42168 TSKgel ButyI-NPR 2.5 pm 4.6mml.D.x10 cm 丁基 反相色谱柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 官能团 封端 19541 TSKgel Super-ODS 2.3 pm 2.0 mml.D.x5 cm C18，多层交联 是 19542 TSKgel Super-ODS 2.3 pm 2.0 mml.D.x10cm C18，多层交联 极性封端 21938 TSKgel ODS-100V 3 pm 2.0 mml.D.x10 cm C18，单交联 极性封端 21829 TSKgel ODS-100V 3pm 4.6 mml.D.x15 cm C18，单交联 极性封端 22707 TSKgel ODS-100V 3 pm 4.6mml.D.x25 cm C18，单交联 极性封端 22712 TSKgel ODS-100V 5 pm 2.0 mml.D.x10 cm C18，单交联 极性封端 21458 TSKgel ODS-100V 5 pm 2.0 mml.D.x15 cm C18，单交联 极性封端 22713 TSKgel ODS-100V 5 pm 2.0 mml.D_x25 cm C18，单交联 极性封端 13357 TSKgel OligoDNARP 5 pm 4.6 mml.D.x15 cm C18，单交联 否 亲水色谱柱 货号 产品名称 粒径 色谱柱尺寸 23455 TSKgel Amide-80 2 pm 2.0 mml.D.x10 cm 23456 TSKgel Amide-80 2 pm 2.0 mml.D.x15 cm 21865 TSKgel Amide-80 3 pm 2.0 mml.D.x15 cm 21867 TSKgel Amide-80 3pm 4.6 mml.D.x15cm 19696 TSKgel Amide-80 5 pm 2.0 mml.D.x15 cm 13071 TSKgel Amide-80 5 pm 4.6 mml.D.x25 cm 21982 TSKgel Amide-80 HR 5pm 4.6 mml.D.x25 cm 东曹(上海)生物科技有限公司 地址：上海市虹梅路1801号A区凯科国际大厦1001室 电话：021-34610856 传真：021-34610858邮箱： i nfo.tbs@tosoh.com.cn 网址： https：//www.separations.asia.tosohbioscience.com 欢迎关注东曹生物微信公众号，获取更多产品资讯 TSK-GE L、TSKgel 是 TOSOH 公 司 的注册商标 。 TOSOH 公 司 版权所 有 ，未 经 TOSOH 公 司 书面同意，本数据集中的内 容 不得全 部 或部分使用或复制。 本数据集的内容可 能会 随公 司产品 的变化而发生更 改 ，恕不 另 行通知 。