采用TSKgel Amide-80色谱柱液质联用法分析珍珠粉中氨基酸

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珍珠为珍珠贝科动物马氏珍珠贝等双壳类受刺激形成。珍珠粉含有多种活性成分，包括氨基酸类、牛磺酸、小分子活性肽等活性成分，具有安神定惊、明目消翳、解毒生肌、润肤祛斑等功效。中国是珍珠的主要生产国之一，淡水珍珠养殖产业繁茂，但缺乏规范性管理，产销分离，且珍珠常作为保健产品，需求量大，所以市场上常有以次充好，以假乱真的现象。这里分享的文献中，作者采用东曹HILIC色谱柱TSKgel Amide-80，液质联用技术( HPLC-MS/MS) 对不同来源珍珠粉中氨基酸含量进行测定和质量评价。实验结果表明：可在10 min内完成分离与测定，该方法操作简单、无需衍生化等繁琐操作，快速、线性关系良好，具有较好的重现性和准确度，可以用于珍珠粉中氨基酸类成分的测定及质量评价。采用 TSKgel Amide-80 色谱柱液质联用法分析珍珠粉中氨基酸 【基本信息】 珍珠为珍珠贝科动物马氏珍珠贝等双壳类受刺激形成。珍珠粉含有多种活性成分，包括氨基酸 类、牛磺酸、小分子活性肽等活性成分，具有安神定惊、明目消翳、解毒生肌、润肤祛斑等功 效。中国是珍珠的主要生产国之一，淡水珍珠养殖产业繁茂，但缺乏规范性管理，产销分离，且珍珠常作为保健产品，需求量大，所以市场上常有以次充好，以假乱真的现象。这里采用 TSKgel Amide-80 色谱柱，液质联用技术( HPLC-MS/MS) 对不同来源珍珠粉中氨基酸含量进行 测定和质量评价。 【分析条件】 色谱柱 ： TSKgel Amide-80(2.0 mmI.D.x15 cm， 3 um) 流动相A ：0.2%甲酸水溶液 流动相B ：乙腈 梯度 ：0~3/5 min， 60%~80%B； 3.5~4.5 min， 80%B； 4.5~4.6 min， 80%~60%B； 4.6~6.1 min，60%B；流速为0.2 mL/min； 柱温 ：40℃： 进样量 ：2pL 流速 ：0.2mL/min 温度 ：40℃ 质谱条件牛：正离子、多反应检测(MRM)， 气帘：241.32 kPa， 离子化温度：550℃，喷雾电压：5500 V 【溶液配制】 对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的丝氨酸( Ser) 、谷氨酸( Glu)、苏氨酸(Thr)、组氨酸( His)、甘氨酸( Gly)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、精氨酸( Arg)、脯氨 酸( Pro)、亮氨酸( Leu)、苯丙氨酸( Phe)、酪氨酸( Tyr)对照品适量，加0.1%甲酸溶液溶解，制成浓 度均为 1.0 mg/mL 的对照品储备液。取不同体积的对照品储备液，稀释成浓度依次为10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032 ug /mL 的混合对照品溶液。 供试品溶液的制备：根据文献[2]及药典方法[3]，将珍珠洗净、干燥、碾细，照水飞法制成最细粉。取珍珠粉样品 1.0 g，精密称定，加6 mol/L盐酸 2mL，静置10 min， 于 4000 r/min 室温离心15 min，弃上清液，得粗蛋白，加水5mL， 吹打离心洗涤2次，除盐。取洗涤后所得粗蛋白加6mol/L盐 酸3mL， 于110℃加热水解 36h，取出，放冷，挥干，得氨基酸残渣。取上述残渣，用水溶解，置于 10 mL 量瓶中，用少量水洗涤试管3次，洗液合并于容量瓶中，定容，摇匀，加0.1%甲酸 溶液稀释50倍，摇匀，用0.22 um 微孔滤膜过滤，即得。 【测定方法】 以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立回归方程。得到14个氨基酸的线性关系，线性相 关系数R范围为：0.9964~1.0000，以3倍信噪比确定方法的检测限范围为：0.0010~0.0228 pg/mL，以10倍信噪比确定为方法的定量限范围为：0.0032~0.0560 pg/mL。平行制备6份供试品溶液计 算得到14个氨基酸峰面积的RSD为：1.53%~2.82%，表明该方法重复性良好。 图114个 氨基 酸对照品溶液(400 ng/mL ) 的 HPLC-MS/MS(MRM)色谱 图 1. Pro 2. Asp 3. Phe 4. Thr 5. Leu 6. Tyr 7. Ser 8. Val 9.Gly 10.Ala 11. His 12. Lys 13. Glu 14. Arg 【结论】 采用 TSKgel Amide-80 色谱柱液质联用法测定珍珠粉中的氨基酸，可在 10 min 内完成分离与 测定，该方法操作简单、无需衍生化等繁琐操作，快速、线性关系良好，具有较好的重现性和准确 度，可以用于珍珠粉中氨基酸类成分的测定及质量评价。 【参考资料】 1.王姣姣 ，徐 迪 辉，周婧马宏 跃，王恒斌，狄 留庆 ，段金廠 ，等.不 同来源 珍 珠 粉中氨 基酸类成分的 HPLC-ESI-MS/MS 分析 与 评 价[J].中 药材，2021，44(7)：1668-1674. 2. Zhang JX， Li SR， Yao S， et al . Ultra-performance liquid chromatography o f amino acids for the qual i ty assessment o f pearl powder [J ].J Sep Sc i ，2015，38(9)：1552-1560 3.国 家 药 典 委员 会 .中 华人 民 共 和 国药典[S].一 部 .北 京：中 国 医药科技出版社 ，2020：242-243. 对照品溶液和供试品溶液的配制请参考相关文献[2] 建立HPLC-MS/MS法同时测定珍珠粉中14个氨基酸类成分含量，评价不同来源珍珠粉的质量.方法：采用 TSKgel Amide-80(15 mmx2 mm，3pm)分析柱，以0.2%甲酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱；流速为 0.2 mL/min；检测器为 QTRAP 5500 质谱仪；对50批不同来源珍珠粉中14个氨基酸类成分 进行检测