实验方案：微流控方式制备高单分散性的壳聚糖微球

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实验方案：微流控方式制备高单分散性的壳聚糖微球实验目的：本实验方案通过利用微滴/微球制备仪，以Drop-Surf微滴生成油为油相，以5%壳聚糖为水相制备高单分散的微滴，并与接收液油相中的戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化。最终获得具有极高的单分散性的壳聚糖微球(CV<5%)。引言：壳聚糖是一种功能线性聚合物，是由甲壳素部分去乙酰化而得[1-3]。因其来源广泛、无毒、价格低廉、良好的生物相容性和可降解而备受关注。近年来，壳聚糖作为一种新型功能材料，以纤维、膜、微球和胶囊等形式在蛋白吸附分离、催化剂载体、酶的固定化、重金属吸附和药物释放等方面具有很大的应用潜力[2]。此外，壳聚糖在每个C6原子单元上都有一个游离的氨基，这使得壳聚糖可以与醛基发生Schiff碱反应，且在这一反应过程中生成的C=N键发生n-π*跃迁产生自发荧光[2]。而这种荧光恰恰可以应用于血液循环追踪、细胞外基质表征、体内细胞成像等领域。因此，壳聚糖在生物、医药、化学和环境等领域都有良好的应用前景。壳聚糖微球粒径的均一度控制对其在生物、医药和催化等领域的成功应用至关重要。目前制备壳聚糖微球的方法有乳化固化、简单凝聚、复合凝聚和膜乳化等[2,4]。虽然这些技术完全可行，但也存在着很大的缺点，如产率不稳定、程序复杂、粒径分布不均和重复性差等。因此，开发一种可重复、粒径及均匀度可控的壳聚糖微球制备技术是其成功应用的必要条件。FluidicLab微滴制备平台运用液滴微流控技术，通过微滴/微球制备仪制备高度均一的壳聚糖微滴，再与戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化，最终得到壳聚糖微球。该法操作简便，样品利用率高，制备得到的微球单分散性高(CV<5%)，具有较好重复性。实验材料：试剂微滴生成油(Drop-Surf)破乳剂(Drop-Surf)壳聚糖(Drop-Surf)冰乙酸(Macklin, A801295-500 mL) 戊二醛(50%, Aladdin, G105905-500 mL) 耗材15 mL离心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干1.5 mL离心管若干内/外径0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接头10 mL和20 mL透明玻璃瓶若干0.22 μm针式过滤器(PTFE材质)若干10 mL注射器若干芯片夹具PDMS-FF-100 μm 芯片（FluidicLab）PDMS标准芯片夹设备Fluidiclab微滴/微球制备仪(两通道)辅助设备电脑(Win10 以上系统)高速离心机(湖南湘仪, H1850)普通光学显微镜(用于测微球粒径)实验步骤：1.试剂配制：|a、5%(wt%)壳聚糖水溶液：将0.5 g壳聚糖加入到约9.3 mL的超纯水中，并加入200 μL (约0.2 g)冰乙酸辅助溶解，振荡放置于85 ℃的鼓风干燥箱中加热溶解；待完全溶解后用0.22 μm的针式过滤器过滤备用。|b、1%戊二醛油相溶液：取490 μL微滴生成油，加入体积为10 μL的50%戊二醛，振荡均匀备用。2.微滴制备：|a、微滴/微球制备仪的安装连接微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：① 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”；② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接；③ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(油相15 mL储液池)，B0(压力输出通道二)和B1(水相1.5 mL储液池)连接；④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A1(油相15 mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(水相1.5 mL储液池)和B2(通道二流量传感器)连接；⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)连接；⑥ C为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；⑦ 用PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。|b、FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加：FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分；|c、壳聚糖微液滴的制备：具体操作步骤如下可参考以下视频：微流控应用：壳聚糖微球制备-保姆级实验视频教程① 分别在15 mL油相储液池(通道一)和1.5 mL水相储液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 5%的壳聚糖水溶液；② FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关；④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液；⑤ 在电脑端设置通道一压力(油相，如150 mbar)和通道二压力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，压力更大)排出管路和芯片中的空气；⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)；将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(油相)和通道二(水相)流速分别为20和5 μL/min；⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出；⑧ 用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性；⑨ 待微滴生成均匀后，即可开始接收至装有1%戊二醛油相溶液的1.5 mL离心管中；⑩ 20 min后停止收集，密封于离心管中，轻微振荡加快微滴固化，随后静置一段时间。3.壳聚糖微球的破乳清洗：具体操作步骤如下(参考视频“微流控应用：微滴生成仪制备壳聚糖微球”)：微流控应用：壳聚糖微球制备-保姆级实验视频教程① 取出1.5 mL离心管底部微滴生成油；② 按V球：V破=1:2 加入破乳剂，振荡破乳；③ 2500 rpm离心处理1 min，并取出底部破乳剂；④ 重复上述②和③操作；⑤ 最终得到固化后的壳聚糖微球。4、微滴/微球制备仪清洗：微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。结果与讨论：刚接收的微滴平均粒径为107.53 μm，具有极高的单分散性(变异系数:CV=2.14%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：‍通过与戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化，最终获得的壳聚糖微球平均粒径为101.67 μm，具有极高的单分散性(变异系数:CV=2.53%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：参考文献：[1] Zhao H., et al. A novel microfluidic approach for monodispersed chitosan microspheres with enhanced autofluorescence, Chem. Eng. J., 215–216, 784-790 (2013). [2] Xu, J.H., et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan Microspheres with Controllable Structures. Adv. Healthcare Mater., 1, 106-111 (2012).[3] Zhu Y., et al. Microfluidic synthesis of thiourea modified chitosan microsphere of high specific surface area for heavy metal wastewater treatment, Chin. Chem. Lett.,28, 633-641 (2016).[4] Xu, J.H., et al. Preparation of monodispersed chitosan microspheres and in situ encapsulation of BSA in a co-axial microfluidic device. Biomed Microdevices, 11, 243–249 (2009).FluidicLa6@Q值得您信赖的微流控合作伙伴www.fluidiclab.com 021-65103566 实验方案：微滴/微球制备仪制备壳聚糖微球 实验目的： 本实验方案通过利用微滴/微球制备仪，以Drop-Surf微滴生成油为油相，以5%壳聚糖 为水相制备高单分散的微滴，并与接收液油相中的戊二醛发生 Schiff碱反应实现微滴的 固 化。最终获得具有极高的单分散性的壳聚糖微球(CV<5%)。 引言： 壳聚糖是一种功能线性聚合物，是由甲壳素部分去乙酰化而得[1-3]。因其来源广泛、无 毒、价格低廉、良好的生物相容性和可降解而备受关注。近年来，壳聚糖作为一种新型功 能材料，以纤维、膜、微球和胶囊等形式在蛋白吸附分离、催化剂载体、酶的固定化、重 金属吸附和药物释放等方面具有很大的应用潜力[2]。此外，壳聚糖在每个C6原子单元上都 有一个游离的氨基，这使得壳聚糖可以与醛基发生Schiff碱反应，且在这一反应过程中生 成的C=N键发生n-π*跃迁产生自发荧光[2]。而这种荧光恰恰可以应用于血液循环追踪、细 胞外基质表征、体内细胞成像等领域。因此，壳聚糖在生物、医药、化学和环境等领域都 有良好的应用前景。 壳聚糖微球粒径的均一度控制对其在生物、医药和催化等领域的成功应用至关重要。目前制备壳聚糖微球的方法有乳化固化、简单凝聚、复合凝聚和膜乳化等[2，4]。虽然这些技 术完全可行，但也存在着很大的缺点，如产率不稳定、程序复杂、粒径分布不均和重复性 差等。因此，开发一种可重复、粒径及均匀度可控的壳聚糖微球制备技术是其成功应用的 必要条件。FluidicLab微滴制备平台运用液滴微流控技术，通过微滴/微球制备仪制备高度 均一的壳聚糖微滴，再与戊二醛发生 Schiff碱反应实现微滴的 固化，最终得到壳聚糖微球。该法操作简便，样品利用率高，制备得到的微球单分散性高(CV<5%)，具有较好重复性。 实验材料： 试剂 微滴生成油(Drop-Surf，FluidicLab) 破乳剂(Drop-Surf，FluidicLab) 壳聚糖(FluidicLab) 冰乙酸(Macklin，A801295-500mL) 戊二醛(50%，Aladdin，G105905-500mL) 耗材 15mL离心管(Falcon15mLREF352097)若干 1.5mL离心管若干 内/外径0.25/1.6mmPEEK管及所需接头 10mL和20mL透明玻璃瓶若干 0.22μm针式过滤器(PTFE材质)若干 10mL注射器若干 芯片夹具 PDMS-FF-100μm芯片（FluidicLab） PDMS标准芯片夹具 设备 Fluidiclab微滴/微球制备仪(两通道) 辅助设备 电脑(Win10以上系统) 高速离心机(湖南湘仪，H1850) 普通光学显微镜(用于测微球粒径) 1.试剂配制： 1. 5%(wt%)壳聚糖水溶液： 将0.5g壳聚糖加入到约9.3mL的超纯水中，并加入200μ L(约0.2g)冰乙酸辅助溶解，振荡放置于85℃的鼓风干燥箱中加热溶解；待完全溶解后用0.22μm的针式过滤器过滤备 用。 2. 1%戊二醛油相溶液： 取490μ L微滴生成油，加入体积为10μL的50%戊二醛，振荡均匀备用。 2.微滴制备： 1.微滴/微球制备仪的安装连接 微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2.微滴/微球制 备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)： ①用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”； ②将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接； ③用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(油相15mL储液池)，B0(压力输出通道二)和B1(水相1.5mL储液池)连接； ④用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25mm/1.6mm)分别将A1(油 相15mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(水相1.5mL储液池)和B2(通道二流量传感 器)连接； ⑤用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25mm/1.6mm)分别将A2(通 道一流量传感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(PDMS芯片的 水相入口)连接； ⑥C为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封； ⑦用PEEK管(内/外径 0.25mm/1.6mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。 2.FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加： FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册 V.1.0》中“3.1FluidicLabSuite软件的安装”的部分； 3.壳聚糖微液滴的制备： 具体操作步骤如下(参考视频“微流控应用：微滴生成仪制备壳聚糖微球”)： ①分别在15mL油相储液池(通道一)和1.5mL水相储液池(通道二)中依次加入5mL 微滴生成油和1mL5%的壳聚糖水溶液； ②FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)； ③打开空气压缩机和气源处理装置开关； ④在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液； ⑤在电脑端设置通道一压力(油相，如150mbar)和通道二压力(水相，如900mbar，水相黏度大，流阻大，压力更大)排出管路和芯片中的空气； ⑥待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)；将整个系统由压力控制切换到 4 流速控制，并设置通道一(油相)和通道二(水相)流速分别为20和5μL/min； ⑦调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出； ⑧用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性； ⑨待微滴生成均匀后，即可开始接收至装有1%戊二醛油相溶液的1.5mL离心管中； ⑩20min后停止收集，密封于离心管中，轻微振荡加快微滴固化，随后静置一段时间。 3.壳聚糖微球的破乳清洗： 具体操作步骤如下(参考视频“微流控应用：微滴生成仪制备壳聚糖微球”)： ①取出1.5mL离心管底部微滴生成油； ②按V球：V破=1：2加入破乳剂，振荡破乳； ③2500rpm离心处理1min，并取出底部破乳剂； ④重复上述②和③操作； ⑤最终得到固化后的壳聚糖微球。 4.微滴/微球制备仪清洗： 微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球 制备仪操作指导卡”。 结果与讨论： 刚接收的微滴平均粒径为107.53μm，具有极高的单分散性(变异系数：CV=2.14%)。其 显微镜图和粒径分布如下图所示： 通过与戊二醛发生 Schiff碱反应实现微滴的 固化，最终获得的壳聚糖微球平均粒径为 101.67μm，具有极高的单分散性(变异系数：CV=2.53%)。其显微镜图和粒径分布如下图所 示： 参考文献： [1]ZhaoH.，etal.Anovelmicrofluidicapproachformonodispersedchitosanmicrospheres withenhancedautofluorescence，Chem.Eng.J.，215–216，784-790(2013). [2] Xu， J.H.， et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan MicrosphereswithControllableStructures.Adv.HealthcareMater.，1，106-111(2012). [3]ZhuY.，etal.Microfluidicsynthesisofthioureamodifiedchitosanmicrosphereofhigh specific surface area for heavy metal wastewater treatment， Chin. Chem. Lett.，28， 633-641(2016). [4] Xu， J.H.， et al. Preparation of monodispersed chitosan microspheres and in situencapsulationofBSAinaco-axialmicrofluidicdevice.BiomedMicrodevices，11，243–249(2009). 021-65103566www.fluidiclab.com 扫码关注FluidicLab微信服务号 收藏FluidicLab淘宝店铺