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本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 - 线性离子阱质谱仪 (Vanquish Duo-LTQ XL)在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析 方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42 秒(包括进样针清洗、 进样和质谱数据采集),利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品 进行快速除盐分析,测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm (表 4)。建立的在线除盐方法快速简便,质谱鉴定准确度高,样 品分析周期非常短(42 秒),24h 内可以分析高达 2000 个样品, 满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。thermoscientific 在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸 杨艳 1,程汉兴 1,刘晓达 1,金燕 1* 赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词:在线脱盐,高通量,寡核苷酸,液质联用 前言 寡核苷酸是一类短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸及核糖核 酸),如用于基因扩增和基因诊断的 PCR 引物和反义核酸,介导 基因沉默的小干扰 RNA (small interfering RNA ,siRNA )等,努力 研究开发基因靶向治疗药物用于治疗病毒、肿瘤和遗传疾病。天然 的寡核苷酸在体内容易降解,稳定性差。通过修饰的寡核苷酸具有 较好的药学特性和体内稳定性 [1-2],但合成的寡核苷酸产物含有各 种杂质,需纯化精制,产物的鉴定和产品的质量控制至关重要。 液相和液质联用于寡核苷酸目标产物的高分辨分离和鉴定,可以 判断待测寡核苷酸结构的变化,比如脱嘌呤、氧化、磷酸化等。寡 核苷酸样品中存在的盐分会影响其离子化过程和造成峰强度降低,因此有必要进行质谱鉴定前的除盐处理。常规离线除盐方法耗时;可以利用在线除盐方式进行寡核苷酸的分离鉴定,但样品通量需要 提高,以满足高通量的要求,如平均每天 2000个样品的需求等。 本工作中,我们利用阀切换技术 [3-5]对寡核苷酸样品进行在线 除盐,建立简单、快速、高效的超高效液相色谱线性离子阱 质谱仪(Vanquish Duo-LTQ XL )在线除盐和寡核苷酸分子量 测定的分析方法。 实验方法 1.仪器和耗材 •包括下列模块和组件的 Thermo Vanquish Duo 超高效液相色 谱系统 泵:Dual Pump (P/N VF-P32-A ) 自动进样器:Split Sampler FT (P/N VF-A10-A ) 柱温箱:Column Compartment H (VH-C10-A ) •质谱仪:Thermo ScientificTM LTQ-XL 质谱 •分流器:Analytical Scientific Instruments (Model No.600-PO10-06) •色谱柱:Acclaim Polar Advantage II 2.试剂 甲醇(质谱级,Fisher 公司)、三乙胺(Sigma )、六氟异丙醇(Sigma ),去离子水(18.2M Ω ) 3.样品 合成的不同分子量的寡核苷酸含盐的样品来源于客户。 4.色谱条件和质谱条件 色谱柱:Acclaim Polar Advantage II (C18-2×10 mm 5 pm ) 柱温:30℃ Vanquish Duo 右泵(平衡泵)流动相 A :0.75%六氟异丙醇和 0.038%的三乙胺的水溶液 Vanquish Duo 左泵(分析泵)流动相 B :0.75%六氟异丙醇和 0.038%的三乙胺和 90%甲醇溶液 色谱方法见表 1和表 2,质谱条件见表 3。 时间(min) 流速(mL/min) %A 0 2 100% 0.5 2 100% 表 1.右泵流路色谱方法 时间(min) 流速(mL/min) %B 0 1.5 100% 0.5 1.5 100% 表 2.左泵流路色谱方法 离子源参数 Sheath Gas Flow Rate 40 Aux Gas Flow Rate 10 Sweep Gas Flow Rate 0 Spray Voltage -3.5kv Capillary Temp 360 Capillary Voltage -20 Tube Lens -40 采集模式 负离子模式 扫描范围 50-2000 SID 30ev 表 3.质谱条件 脱 盐 柱 1:上 样 和 脱 盐 图 1.快速除盐的串联管路连接图(U 代表上阀,L 代表下阀) 实验结果与讨论 1.色谱柱串联在线除盐 [6] 利用图 1的串联配置可以加速脱盐和洗脱过程。在线除盐和分析的 整个过程主要分为两个部分:(1)样品上样至脱盐柱 1,在流速 2mL/min 的除盐水相条件下,样品中的盐快速被除去,待测样品保 留在脱盐柱上;(2)进行阀切换,洗脱有机相快速进入脱盐柱 1,将待测样品从脱盐柱 1上洗脱进入质谱检测。 2. Vanquish Duo 串联 MS (LTQ XL )进行寡核苷酸定性分析 图 3-5所示,为寡核苷酸样品 S1和 S2的质谱总离子流谱 图,响应良好,测得质谱原始数据须保存为 Proflie 格式,通过 BioPharmaFinder 软件 Intact 分析进行去卷积分析,得到相应的寡 聚核苷酸样品分子量(图 6-8)和去卷积后匹配原始谱图(图 9-11) 图 3. S1寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC ) N L : 1.40E 7 s10 图 4. S2寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC ) NL : 1.06E 7 图 5. S3寡核苷酸样品质谱总离子流谱图(TIC ) 图 6. S1寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 7. S2寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 8. S3寡核苷酸样品去卷积后分子量 图 9. S1寡核苷酸样品匹配原始质谱图 s10 #3-16 RT:0.063-0.435 A V:14 图 10. S2寡核苷酸样品原始质谱图 图 11. S3寡核苷酸样品原始质谱图 样品 理论分子量(Da) 实测分子量(Da) 差异 delta mass(Da) S1 29331.07 29333.57 2.50 S2 23010.91 23012.78 1.87 S3 26103.9 26106.29 2.39 表 4.实际测得分子量和理论分子量差异 结论 本文建立了简单、快速、高效的液相色谱 -线性离子阱质谱仪 (Vanquish Duo-LTQ XL )在线除盐和检测寡核苷酸分子量的分析 方法。该方法一个样品的整个分析周期为 42秒(包括进样针清洗、进样和质谱数据采集),利用该方法对不同分子量的寡核苷酸样品 进行快速除盐分析,测定分子量与理论分子量平均偏差约 100 ppm (表 4)。建立的在线除盐方法快速简便,质谱鉴定准确度高,样 品分析周期非常短(42秒),24h 内可以分析高达 2000个样品,满足寡核苷酸样品的高通量分析要求。 参考文献 1.贾巧云、邓新秀、高婵等 .反相离子对高效液相色谱法分析硫代反义寡 核苷酸 CT102相关杂质。药物分析杂质 2013,33(7):1157-1162 2. Martin Gilar.,et al.Characterization of therapeutic oligonucleotides using liquid chromatography with on-line mass spectrometry detection[J].Oligo mucleotides,2003,13:229-243 3. 1. Opiteck G J, Lewis K C, Jorgenson J W, et al. Comprehensive on-line LC/LC/MS of proteins[J]. Analytical Chemistry, 1997, 69(8):1518-1524. 4. 2.Wei J, Sun J, Yu W, et al. Global Proteome Discovery Using an Online Three-Dimensional LC−MS/MS[J]. Journal of Proteome Research, 2005,4(4):801-808. 5. 3.Yoshida H, Mizukoshi T, Hirayama K, et al. On-line desalting-mass spectrometry system for the structural determination of hydrophilic metabolites, using a column switching technique and a volatile ion-pairing reagent.[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1119(1):315-321. 6. on-line high-throughput desalting to prepare samples for mass spectrometry.application update 174
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赛默飞色谱与质谱为您提供《在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸》,该方案主要用于生物药品药物研发中液质联用分析寡核苷酸检测,参考标准《暂无》,《在线脱盐高通量液质联用分析寡核苷酸》用到的仪器有LTQ Orbitrap XL ETD高分辨质谱仪 、赛默飞 Acclaim液相色谱柱系列。
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