移液工作站在猪瘟间接ELISA抗体检测中的应用

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猪瘟间接ELISA抗体检测步骤猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。一、实验试剂1、包被抗原:杆状病毒表达的ASFVP30重组蛋白。2、酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗。3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液（配制方法：  Na2CO3  0.318g；NaHCO3  0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS ) （配制方法： pH7.4 PBS  1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS) （配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA  10 g 现配现用）6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml  现配现用）7、 TMD底物溶液（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。  底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）8、终止液(2 mol/1 硫酸)（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）二、仪器设备1、酶标仪。 2、恒温孵育箱。3、洗板机或洗涤瓶。4、96孔酶标板。FDT-CIH-F8T5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-3007、4道储液槽60ml 1个 RES-60-48、封板膜 FDT-CP309、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF三、试验程序包被酶标板用包被缓冲液将ASFV P30重组蛋白稀释至终浓度0.3μg/ml,每孔100μL包被96孔酶标板奇数条作为检测孔,使用抗原稀释液包被96孔酶标板偶数条作为对照孔,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。四、实验步骤（图片仅为实验模拟图）第一步：用移液工作站将待检血清与阴性、阳性对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。     第二步：酶标板上对照和待检样品的分布图,见下图。50μL/孔,在A1、A2和B1、B2孔中加入稀释后的阳性对照血清,在 C1、C2和 D1、D2孔中加入稀释后的阴性对照血清,在E1、E2等其余孔加入稀释后的待检血清,37℃孵育60min。样品加样记录表12356789101112APPBPPCNNDNNEFGH说明：P为阳性对照N为阴性对照空白为待检样品孔第三步：弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔。第四步：每孔加入酶标抗体(1x),50μL/孔,37℃孵育30 min。第五步：弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔第六步：每孔加入底物溶液,50μL/孔，室温避光作用10min。第七步：每孔中加入50μL终止液,终止反应。第八步：用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值,按下列算式计算OD450差值。OD450-c=OD450-J-OD450-O         式中:OD450-c——OD450差值;OD450-J——OD450奇数孔值;OD450-O ——OD450偶数孔值。