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实验十八 淀粉酶活力的测定
一、目的
学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。
二、原理
淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
萌发的小麦种子（芽长约1cm）
2．仪器
（1）离心机
（2）离心管
（3）研钵
（4）电炉
（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1
（6）恒温水浴
（7）20mL具塞刻度试管×13
（8）试管架
（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1
（10）分光光度计
3．试剂（均为分析纯）
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。
（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液
A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7•H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7•2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。
取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
四、操作步骤
1．麦芽糖标准曲线的制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：
表1 麦芽糖标准曲线制作
试 剂    管 号
    1    2    3    4    5    6    7
麦芽糖标准液（mL）    0    0.2    0.6    1.0    1.4    1.8    2.0
蒸馏水（mL）    2.0    1.8    1.4    1.0    0.6    0.2    0
麦芽糖含量（mg）    0    0.2    0.6    1.0    1.4    1.8    2.0
3,5-二硝基水杨酸（mL）    2.0    2.0    2.0    2.0    2.0    2.0    2.0
摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2．淀粉酶液的制备
称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。
吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
2．    2．酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。
表2 酶活力测定取样表
操 作 项 目 α 淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定
Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6
淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min，冷却
淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0
3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0
预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min
3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0
将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。
五、结果计算
计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。

计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。

β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力
六、附 注
（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。
（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。
（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。
七、思考题
1．为什么要将Ⅰ- 1、Ⅰ- 2、Ⅰ- 3号试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中保温15min？
2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40℃水浴中保温？
参考答案
1．由于β-淀粉酶不耐热，70℃15min被钝化，所以将此3个试管中的溶液在70℃保温15min使其钝化，从而测得的淀粉酶活性即为α-淀粉酶活性。
2．酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40℃是淀粉酶的最适温度，所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更加准确。

实际的测定结果如何？

吸光度确实低点,一般应在0.1以上

在合理范围内就不低，应按照规程操作。