熊猫宝宝
第1楼2008/08/29
3.4衍生化
不用很复杂的操作就可用化学衍生将薄层转变成可见的色谱结果或提高检出度。多数常见的衍生化试剂配成溶液使用。将展开过的薄层板喷上或浸入上述溶液。虽然在各论中多采用喷雾法,但是除非使用专门的设备,喷雾显色很难标准化。喷雾显色需要很好的技巧。喷到薄层板上的溶剂量,以及在薄层板上的均匀程度很难在方法中精确地描述。这使这个步骤几乎不可能完全重现。喷雾显色的另外一个缺点就是会产生有毒气体。
浸板显色法相对容易操作和控制。显色剂的浓度和浸入的时间、速度等都可以设定从而得到可重现的结果。薄层板上的溶剂也很均匀,保证了定量分析结果的正确性。在浸板过程中也不会产生溶剂气体。一般化学衍生都包含加热步骤,这些都应在方法中精确地描述。“在某一特定温度加热××分钟或至颜色出现”并不足以确保结果的重现。
显然,在一般方法学部分不能将衍生化规定得太详细,但是在各论中应将衍生化的步骤精确定义。应该细化的参数包含在衍生化前如何处理展开后的薄层板,在浸板后薄层板的干燥条件,如果需要加热还应包含加热前和加热后的等待时间。图8是金丝桃提取物在高效薄层板上用天然产物试剂/聚乙二醇衍生化时在不同衍生化方法下的结果。
3.5记录
薄层色谱的一个独特的优点,并使该方法与其它色谱方法相区别的就是薄层色谱可以得到一个图片以反映和表达色谱的结果。现在可以使用摄相机、数码相机甚至电脑扫描仪将薄层色谱转变为电子图象。
在现行药典中针对薄层色谱的描述并没有将结果完全、详细和客观地表达出来。例如在欧洲药典中所描述的茴香油(也包含八角茴香油)的鉴别实验结果。在紫外254nm下,样品显示两个斑点分别对应于茴香醛和大茴香醚(茴香脑)。在用香草醛显色后,样品显示对应于芳樟醇和大茴香醚的斑点,它们是接近于溶剂前沿的紫红色斑点。此外Pimpinella anisum 可能在茴香醛斑点上显示一个棕色斑点。
表2 药典茴香油鉴别实验结果描述表(其它斑点将口头描述)
薄层板顶端
薄层板顶端
大茴香醚:一个淬灭斑点
一个淬灭斑点(大茴香醚)
——
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茴香醛:一个淬灭斑点
一个淬灭斑点(茴香醛)
——
——
对照溶液
样品溶液
薄层板顶端
薄层板顶端
一个紫色斑点(单萜烃类)
大茴香醚:一个橙色-粉色斑点
一个橙色-粉色斑点(大茴香醚)
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——
——
芳樟醇:一个蓝色斑点
一个蓝色斑点(芳樟醇)
对照溶液
样品溶液
欧洲药典用表格来体现薄层结果(表2),可以更好地表达相对位置,较原来有所进步。但是并不能完全替代薄层图的作用,如图9所示。
很明显,在这个例子中,口头表达或表格描述均不能完全表达两种油的薄层结果。在图谱中标有黄色箭头的斑点均未提及,也未认可“其它”斑点的出现。然而更重要的问题是,是否这些样品可以通过药典茴香或八角茴香油的鉴别实验。薄层图表明,这两个油有明显的差别并很容易区别。(注意:现在药典中的茴香和八角茴香油的各论正在修订中)
和其它薄层步骤一样,采用电子记录设备进行薄层记录时所有的参数必须精确地界定并实施以确保结果的重现性。可以预测,在不久的将来,薄层色谱的电子图象将成为图谱的基础,并将成为药典植物药各论的实用附录。如果不仅仅提供该植物的一张指纹图谱,而是收录多种检测下的薄层的图片,这将是该图谱的一个独特优点。此外可通过在同一块薄层板上分析几批有代表性的样品来考察每一种植物的自然差别。还可将常见替代品的指纹图谱收录其中。
3.6标准化和国际协调
在以上部分中,我们讨论了薄层色谱各步骤中的几个重要参数,并对欧洲药典通则和各论项下的改进提出了建议。然而应该引起注意的是,提供一个适宜的框架并不足以实现现代薄层色谱的所有潜能。应同时采用新的标准化的方法学表述。这些表达应类似于SOP,可包含于各论的详细技术指导中。在图10中的例子说明了这个问题。实验室A建立了一个高效薄层色谱鉴别当归Angelica sinensis和欧当归Levisticum officinale的方法,他们把这个方法用文字记录下来并交给了实验室B进行复核。两个实验室都认为他们完全按照方法进行了操作,所得到的结果虽然相似,但并不是完全相同。以下详细比较了两个实验室的操作上的不同,虽然他们都认为“采用了正确方法进行实验”。
图10 两个实验室归Angelica sinensis和欧当归Levisticum officinale高效薄层色谱鉴别
实验细节
实验室A
实验室B
展开剂
甲酸:乙酸乙酯:甲苯 (10:10:90 V/V)
预洗
无
甲醇-氯仿(105℃下干燥30分钟)
饱和情况
20分钟(滤纸)
15分钟(没有滤纸)
衍生化方法
浸板
喷雾
记录
摄像,反射+透射
电脑扫描仪扫描
薄层板活化
在实验室中平衡(相对湿度40%)
P2O5干燥一夜,相对湿度未知
图11是金花菊(Echineacea spp)的高效薄层色谱鉴别结果。这个实验严格按照标准方法操作。这个方法按照AOAC同等验证方法程序指导原则进行过确认。两个实验室在不同的时间均得到了几乎相同的结果。这个方法已经上交欧洲药典注释(狭叶金花菊根,白色金花菊根,和紫色金花菊根)。
4、结论
基于理论和实践考虑,有必要对欧洲药典中关于薄层色谱一般方法学部分进行审议。在新增和修订药用植物各论时应包含有采用现代标准化方法学的薄层色谱鉴别。主要需考虑以下因素:
(1)薄层色谱方法一般应采用高效薄层板。
(2)为得到最好的定性定量分析结果,样品应采用喷雾点样,样品点应呈条带状。
(3)建议一般展开高效薄层板先预饱和,展开距离超过6cm。
(4)采用颜色反应以得到可见的薄层色谱结果的,应详细描述衍生化步骤。
(5)除采用描述方法外,还应用彩色图片以图籍的方式提供薄层结果。多个图象(如在紫外254nm,紫外366nm,可见光下的图象)有利于分析结果的判断。也应考虑为产品提供对照物质。
薄层色谱方法学的标准化是分析结果可比性的基本要求。