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【求助】SOS——请教关于液相转液质时方法建立的问题

液质联用(LCMS)

  • 测血药浓度,之前用HPLC,灵敏度不够,现想改用LC-MS/MS,以前从未用过,查了这方面的一些文献,还有几点问题想向高手请教一下:

    1. 关于建立LC-MS/MS方法学中内标的选择问题
    在我所查到的文献中,所选择的内标,基本上都是待测药物结构类似物(仅某几个官能团的区别),或者是待测药物的放射性标记产物,想请教下,是否在做LC-MS/MS时,内标选择必须如此?这二者对我而言都不太易获得,可否继续用我在做HPLC时选择的内标?尽管此内标与待测药物结构很不一样,不过在液相条件下保留时间接近,而且在样品处理过程中是很稳定的。不知这样是否可行?

    2. 关于样品处理方面的问题
    LC-MS/MS是否要求样品很干净?我做的是血样,处理方法是用甲基叔丁基醚萃取吹干重溶,是否需要求萃取剂是色谱纯(色谱纯和分析纯价格差别还是蛮大的)

    3. 关于色谱柱选择的问题
    液相使用的是C18,200mm长,流速1.0,一个样大概跑12分钟左右,但是LC-MS/MS要求流速最好小于0.3,这样一个样的时间是原来的三倍多,是不是要换短点的柱子?(文献上用的都只有50mm左右)对分离度是不是会有影响?

    4. 关于流动相的问题
    公共实验平台仪器收费比较高,老师建议我最初摸条件还是在液相上(之前流动相内有磷酸盐,所以不能用),我想请教下,究竟要在液相上分成个什么样算是条件摸好了,因为听说如果不是分得很开也不要紧?是指药物和内标?或者出峰时间内有杂质也可以?

    5. 关于进样体积的问题
    因为是自动进样,是否有要求每个样品的体积不小于多少?

    因为液质太贵了,所以老板一直希望我用HPLC可以做出来,前段时间做得叫一个郁闷呐~现在老板终于同意用液质了,一定得做出来,压力比较大。听师兄师姐推荐这个论坛,我就来逛逛,难得碰到这么多有经验的前辈,赶紧抓紧时间问问。因为是新手,问题比较弱智点,o(∩_∩)o...,希望大家多多指教,谢谢。
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  • zhufangwei

    第1楼2008/09/18

    1、内标选择的原则就是待测药物结构类似物(仅某几个官能团的区别),或者是待测药物的放射性标记产物啊,HPLC和LC-MS/MS都是一样的啊,不知道你HPLC用的是什么内标,也可以用外标法做啊,内标相对麻烦的多,如果不是刻意要求用内标,建议你就用外标。你用的是等度液相条件吧,可以尝试用一下梯度。
    2、最好过固相萃取柱,因为血液中成分比较复杂,蛋白特别多,很容易将离子传输管堵住。提取液用分析纯啊
    3、液相液相质谱的条件是不一样的啊,两者可以相互借鉴的就是流动相的比例成分。
    4、当然是两个峰要完全分开,前处理肯定要做干净,不然你仪器够受的。
    5、看你用什么进样瓶了,一般就1mL的量。如果自己实验室没有这样的仪器,要完全去摸索方法,的却花费很大。

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  • 风之彩

    第3楼2008/09/20

    1. 关于建立LC-MS/MS方法学中内标的选择问题
    在我所查到的文献中,所选择的内标,基本上都是待测药物结构类似物(仅某几个官能团的区别),或者是待测药物的放射性标记产物,想请教下,是否在做LC-MS/MS时,内标选择必须如此?这二者对我而言都不太易获得,可否继续用我在做HPLC时选择的内标?尽管此内标与待测药物结构很不一样,不过在液相条件下保留时间接近,而且在样品处理过程中是很稳定的。不知这样是否可行?
    原则上选择结构相近的或是同位素标记的,如果实在不易得,别的化合物也可以,但是液相上的内标一定使用于质谱,这个还要在质谱上试一下,如果行,那也是可以的。

    2. 关于样品处理方面的问题
    LC-MS/MS是否要求样品很干净?我做的是血样,处理方法是用甲基叔丁基醚萃取吹干重溶,是否需要求萃取剂是色谱纯(色谱纯和分析纯价格差别还是蛮大的)
    我们用过分析纯的,如果不放心,可以把试剂重蒸一下再拿来提取,这样就可以不买色谱纯的了,但是就是自己麻烦一些。

    3. 关于色谱柱选择的问题
    液相使用的是C18,200mm长,流速1.0,一个样大概跑12分钟左右,但是LC-MS/MS要求流速最好小于0.3,这样一个样的时间是原来的三倍多,是不是要换短点的柱子?(文献上用的都只有50mm左右)对分离度是不是会有影响?
    如果不换柱子,可以采取柱后分流的方法。如果换柱子,要用内径小,粒径也小些的柱子。

    4. 关于流动相的问题
    公共实验平台仪器收费比较高,老师建议我最初摸条件还是在液相上(之前流动相内有磷酸盐,所以不能用),我想请教下,究竟要在液相上分成个什么样算是条件摸好了,因为听说如果不是分得很开也不要紧?是指药物和内标?或者出峰时间内有杂质也可以?
    如果一定要用缓冲液,那么要用挥发性的盐,如醋酸铵等,不知道你要测几个成分,其实现在液相上摸不是不可以,只是效果不一定会很好,因为每个液相系统不同,这台液相上摸好了,那台液相的出峰时间等可能不一样,液相上摸个大概就行了,看看峰形不拖尾、前沿,时间差不多就可以了。质谱上的峰尽量在2-3分钟以后出峰,因为血浆中的很多成分在这个时间段出峰,可能会有基质效应。样品峰也尽量不要同时出峰,因为可能会有共流成分之间的抑制作用,影响你样品的信号。

    5. 关于进样体积的问题
    因为是自动进样,是否有要求每个样品的体积不小于多少?
    看你的柱子,如果是你原来液相的柱子,就合你液相进的量差不多,一般也就20uL左右吧,如果是小内径的柱子,那就要少一些,一般5-10uL。

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