一道黑
第1楼2008/11/24
8. 样品和取样程序
此节是根据6.3.3.节和国际标准化组织(ISO)有关文件(ISO 78/2-1982)内容起草的,如下注意事项源于欧盟有关文件的附录(2052/VI/84-EN)。
8.1. 样品性质:按照64/433/EEC指令的定义,样品应达到使残留检测能得以进行。如果没有上述样品,生物液体或排泄物也可作为残留检验的样品。
8.2. 样品量:样品量必须足够大以该法需50g样品完成检验,并且在需要的情况下备有能重复分析的量。
8.3. 样品的抽取和包装方法必须适合在实验室予以识别。
8.4. 包装、存放及传递方法必须保持样品的完整性,不能对检测结果产生不利的影响。用于测定合成激素的样品,必须在低于-18℃温度下保存和传递。如果样品在采集后48小时内分析,就可在0-+4℃保存和传递。
9. 测定步骤
9.1. 初步萃取预处理
9.1.1. 均质和酶消化
从实验室样品中取一个50g实验样品在250mL烧杯中加50mL醋酸缓冲液(6.4.1)混合。加100 L内标液用Ultra-Turrax均质器混均。脂肪组织在80℃被消化,然后用80mL醋酸缓冲液均质。用玻璃电极调pH到5.2并加0.25mL消化液(6.2.14)和滴加少量氯仿。混合物在37℃放置过夜。脂肪组织水解可以忽略。
9.1.2. 净化
9.1.2.1 混合物转移到一离心管中,用180mL甲醇再次均质。混合后于在约2000转/分下离心10min。
上清液轻轻倒入一个分液漏斗并用正己烷50mL/每次,萃取两次。正己烷层弃之。
[注意:甲醇相可能会仍然混浊,但这不影响测定效果。]
9.1.2.2 甲醇相用150,90,90mL二氯甲烷提取三次。合并二氯甲烷相于圆底烧瓶中,用旋转蒸发器在45℃水浴中蒸发至干。在残留物中加入20mL水。
[注意:可以加5-10mL水促进分层。蒸发时可以滴加几滴甲醇以减少暴沸。]
9.2 层析柱
9.2.1 萃取液加至XAD-2树脂柱的顶部。调节滴速约为2mL/min。烧瓶用每次20mL水冲洗两次并转至柱子中,流速约为5mL/min。流出的水弃之。用40mL甲醇通过柱子洗脱合成激素。甲醇在45℃蒸发至干。残渣用1mL氯仿溶解。
9.2.2 5mL甲苯和9mL异辛烷加入氯仿萃取液中(9.2.1)并将溶液定量转移至Extrelut和Al2O3组合柱上(7.2.4)。用每次5mL的甲苯/异辛烷冲洗残液两次并转移至柱子中,流速约为0.5mL/min,分开柱子。
9.2.3 用20mL甲苯/异辛烷混合液洗extrelut柱,雌激素用70mL用乙醚饱和的水以1mL/min速度洗脱。洗脱液收集于存有1mL乙醇的烧瓶中。洗脱液在旋转蒸发器中,于45℃水浴旋转蒸发至干。
9.2.4 用25mL甲苯冲洗Al2O3柱,并用30mL甲苯:乙醇=99:1(v/v)的混合液洗脱雄激素和孕激素。然后加1mL乙醇,混合液在旋转蒸发器中,于45℃水浴旋转蒸发至干。
9.2.5 蒸干的提取物用3×1mL丙酮转移至衍生化瓶中(7.1.11)。溶剂在氮气流下蒸发。
9.3. 衍生化
9.3.1 萃取液(9.2.5)小心在真空箱或在40℃干燥器中干燥。添加100 L甲硅烷基化混合物(6.3),并在60℃金属板上加热10min,混合物用于GC分析。
9.3.2 萃取液9.2.5被小心在真空箱或在40℃干燥器中干燥。添加100 L甲硅烷基化混合物(6.3.2)小心振摇。样液转移到一个圆锥型衍生化瓶中,在60℃烘箱中加热15min。
[注意:甲硅烷基化试剂应预先用标准溶液测试它的均匀性。对己烯雌酚和其它化合物有必要作进一步确证,可用七氟化丁酸酐衍生化试剂来评估(也见M1.1.)]。
9.3.3 HFB-衍生化的准备
用0.5mL无水乙醇将提取净化后获得的残留物转移到衍生化瓶中。蒸发乙醇,并加0.1mL HFBA(63163)的丙酮溶液(1:4,V/V)。衍生化瓶经旋涡混均后在80℃下放置1hr。在50℃氮气流下蒸发反应放置后的混合液至干,并且衍生化后的残留物用0.025mL异辛烷溶解。最终溶液供进GC分析用。
9.4. 气相色谱-质谱
下列条件下GC-MS适于TMS-衍生物和HFB-衍生物的分析。
9.4.1. GC-MS分析条件如下:
GC 毛细管色谱仪(HP 5840)
色谱柱 SE 54,25m×0.32mm,膜厚 0.5 m
进样 2 L,不分流,250℃
载气 He,2.5mL/min
柱前压 0.68bar
程序升温 160℃(1min)-20℃/min-300℃。
接口温度 280℃。
上述条件下保留时间为:二氯酚 8.6min,3,4-13C-睾酮13.3min。
9.4.2.1 选择离子。
在GC-MS分析过程离子监测。
用6.3.1.试剂甲硅烷基化后的TMS-衍生物
雌激素
Dichlorophene (ISTD) 二氯芬 412,414,377,413
DES 己烯雌酚 412,413,397,383
HEX 环己雌酚 207 as HFB 303,331
DE 双烯雌酚 410,395,381,411
Ethinyloestradiol 乙炔基雌二醇 425,440,300,285
Oestradiol (α or β) 雌二醇 285,416,231,232,326
Oestriol 雌三醇 504,345,324,386
Oestrone 雌烷 342,257,218,244
雌激素
3,4-13C-testosterone (I.S.) 3,4-13C-睾酮 362,272,228,347
Testosterone 睾酮 360,270,226,345
Androsterone 雄酮 362,347,272,246
Androstenedione 雄烯二酮 286,201,148,124
Boldenone 358,268,237,194,147,122
Methyltestosterone 甲基睾酮 143,284,240,269,304
19-nortestosterone 19-去甲睾酮 346,331,256,215
Trenbolone 342,252,237,211
孕激素
Progesterone 黄体酮 314,272
Medroxyprogesterone 甲基孕甾酮 373,283,265,145
Hydroxyprogesterone 羟基孕甾酮 359,269,227,145
9.4.2.2 用6.3.2.试剂甲硅烷基化后的衍生物在GC-MS分析过程监测的离子
TMS-衍生化试剂的雌激素
Dichlorophene (I.S.) 二氯芬 412,413,414,377
cis-DES 顺式己烯雌酚 412,413,397,383
trans-DES 反式己烯雌酚 412,413
Hexoestrol 己雌酚 207
Dienoestrol 双烯雌酚 410,395,381,411
Oestradiol 雌二醇 416,285,231,326
Oestriol 雌三醇 504,345,324,386
Oestrone 雌烷 414,399,309,270
雄激素和孕激素TMS-烯醇-TMS衍生物
3,4-13C-testosterone (I.S.) 3,4-13C-睾酮 434,419,303,211
Testosterone 睾酮 432,417,301,209
Androsterone 雄酮 430,234,209
4-chlorotestosterone 4-氯睾酮 466,468
Boldenone 430,431,206,299
Methyltestosterone 甲基睾酮 445,301,314,356
19-nortestosterone 19-去甲睾酮 418,403,287
Progesterone 黄体酮 458,353,443
Medroxyprogesterone 甲基孕甾酮 315,330,455
[注意:1)在Cy1.1.方法中也给出了TMS和HFB衍生物的值。
2)去甲雄三烯醇酮TMSi-酯不稳定,必须在甲硅烷基化后立即进样。
3)不生成去甲雄三烯醇酮TMS-enol-TMS衍生物,可能是去甲雄三烯醇酮在甲基硅烷化的过程中被破坏了。
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10. 结果计算
10.1. 结果的表述
因与内标(ISTD)相比, TMS 衍生物峰面积的响应不一致, 所以应当测定校正因子。校正因子的测定应当在合成激素预计的浓度范围内进行, 这点很重要。内标衍生物的进样量应当在1到10ng范围内。校正因子是根据通常峰面积法计算的。
按以下公式计算
gst × Fx
gx = f ×───────
Fst × E
其中 gx = 合成激素浓度 (μg/kg)
gst = 加入ISTD的量(ng)
Fx = 合成激素衍生物的面积
Fst = ISTD 的面积
f = 校正因子
E = 使用样品的量(g)
10.2. 质量保证方法
10.2.1 质量控制 要求每批样品分析做两个空白样品和五个空白添加2μg/kg标准的样品。被测物的回收率应在50-120%内, 且样品CV值<30%。
10.2.2 以Bergner-Lang, B. and Kachele, M.(Dt. Lebensm . Rundschau, 1989, 85, 78-79)完成的质量控制数据为例, 添加到均质后肾脏组织种的10种合成激素的回收率如下所示;
合成激素名称 n 添加 平均值 回收率 CV
(ug/kg) (%) (%)
DES 5 2 1.3 65 12.2
DEN 5 2 1.34 67 18.0
HEX 5 2 1.34 67 14.5
EE 5 2 1.26 63 15.5
E2α 5 2 1.20 60 33.3
E2β 5 2 1.16 58 16.8
E1 5 2 1.38 69 15.7
E3 5 2 1.16 56 20.8
NT 5 2 1.53 52 40.3
MT 5 2 2.12 70 7.0
10.3. 可靠性
本方法经在德国的七个实验室内用于分析合成激素结果表明非常成功。结果符合EEC section 5 的规定。
实验室间的数据比对表明,小牛肉中DEC和DE可检测的浓度>0.5ug/kg, EE和NT浓度>1ug/kg。HEX,α和β雌二醇,雌烷,雌三醇和甲基睾烷酮都可以由其中一个实验室得到相似的结果和稳定的数据。
11. 特殊情况
例如,若某个被测物的TMS 衍生物存在问题, 就应准备其HFB衍生物分析。
如果是分析幼儿食品, 因含肉量较底, 应取用100 g 样品。
甲基硅烷化过程生成TMS-enol-TMS-衍生物。该法对有问题的样品较脏提取物和痕量激素可以给出很好的结果。 特别是雌激素, 孕激素和雄激素。去甲雄三烯醇酮的TMSi酯不稳定。本法只适用于去甲雄三烯醇酮的TMSi酯制备后进GC分析。没有去甲雄三烯醇酮的TMS-enol-TMS-衍生物生成 。
本法不适用于玉米赤霉醇, 因Extrelut柱对于玉米赤霉醇分离无效。
12. 操作注意事项
根据试剂, 标准品和设备选择操作步骤。
13. 质量控制。标准, 标准物质和抗生素。
重要试剂和标准的来源和质量的描述见 Section 8 。
14,15 略
16. 检验流程图
样品组织 加入缓冲液和回收标准 均质
XAD-2 柱 溶剂提取 水解
Extrelut柱和氧化铝柱
雌激素 雄激素和孕激素
衍生化 GC-MS 计算结果
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标题如下:(陆续上传)
GCMS法测定动物组织中雄激素,雌激素和孕激素的残留量(EEC,确证法)
GC/MS法测定牛肝、肾和肉中-激动剂的三甲基硅烷衍生物(EEC,筛选法)
GC/MS法测定牛尿中 -激动剂三甲基硅烷化衍生物(EEC,确证法)
GC/MS法测定牛血浆和组织中克喘素的残留量(EEC,确证法)
HPLC法测定标准物质和新鲜动物组织中的磺胺二甲嘧啶(EEC,确证法)
HPLC法分析猪肾中磺胺二甲嘧啶(EEC,确证法 )
HPLC在线紫外光谱检测和离线TLC确证猪肾中镇定药和咔唑心安残留
动物毛发、尿液及组织中克喘素(盐酸克仑特罗)及舒喘宁(沙丁胺醇)残留量的测定
动物组织中伊维菌素残留量的测定(EEC 确证法)
放射免疫法(RIA)测定动物组织中玉米赤霉醇的残留物(EEC ,筛选法)
放射免疫法测定肉、牛奶和蛋中的氯霉素残留量(EEC, 筛选法)
蜂蜜中链霉素残留物的Charm II测定和液相色谱柱后衍生化-荧光检测验证
高效薄层层析法(HPTLC)测定动物及动物组织中甲状腺抑制物质的残留量(EEC 筛选法)
高效薄层层析法(HPTLC)和GC-MS法测定动物及动物组织中甲状腺抑制物质的残留量(EEC确证法)
高效薄层色谱法(HPTLC)测定饲养动物肉中磺胺类药物的残留量(EEC,Sg3.2筛选法)
高效液相色谱法(HPLC)测定牛奶中的氯霉素
高效液相色谱法(HPLC)测定禽肉和禽蛋中拉沙里菌素的残留量(EEC,确证法 )
高效液相色谱法(HPLC)确证和测定猪肾或肉组织中的磺胺二甲嘧啶残留量(EEC,确证法)
高效液相色谱法测定动物组织和牛奶中苯并咪唑类残留量(EEC, 确证法)
高效液相色谱法测定动物组织中四环素族抗生素残留量(EEC,确证法)
高效液相色谱法测定牛、羊、猪的肌肉及小牛肌肉、肝、肾和脂肪中庆大霉素和新霉素的残留量 EEC (筛选法)
高效液相色谱法测定猪肉、熏肉及牛肉中的环丙氟派酸和英氟沙星的残留量
高效液相色谱法分析蛋、奶及肉中的硝基呋喃类药物残留(EEC,确证法 )
牛肝中己烯雌酚和玉米赤霉醇的测定和确证
牛尿中残留人工合成激素规检测 ——气相色谱/质谱(EI)法 (该法可扩展为确证法)
牛尿中己烯雌酚残留物的测定——放射免疫法(EEC,筛选法)
气相色谱(GC)法测定玉米赤霉醇
气相色谱一质谱法确证测定肉、牛奶、蛋和尿中的氯霉素(EEC,确证法)
气相色谱/质谱(EI)法常规检测牛尿中人工合成性激素残留物 (EEC,筛选法;该法可扩展为确证法)
气相色谱/质谱法测定牛尿中炔雌二醇残留量(EEC,确证法)
气相色谱-质谱法确定胆汁中玉米赤霉醇的残留物(确证法)
气相色谱—质谱法确证胆汁中1,2—二苯乙烯类药物(EEC,确证法)
气相色谱/质谱联用(GC/MS)确证磺胺类药物的残留(EEC,确证法 )
气质联用法检测动物肝脏中的左旋咪唑(EEC,Sg4.5,本法可扩展为确正方法)
生物样品或动物饲料中β-激动剂的检测和确证方法(EEC, 确证法)
透析分析和在线HPLC测定禽肉中硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的残留量
透析和在线HPLC测定禽肉中硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的残留量(EEC,Sg3.2筛选法)
盐酸克伦特罗的检测和鉴别方法
液相色谱/放射免疫法测定动物组织中己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚的残留量(EEC, 确证法)
用GC/MS检验确证猪肾中镇定药的残留量(EEC, 确证法)
用改良的四碟法检测新鲜肉中抗菌物质EEC (筛选法)
气相色谱法测定玉米赤霉醇