【分享】欧盟兽药检测方法（之六）

7 仪器
7.1 玻璃器皿
7.1.2 圆底具磨口塞离心管， 30mL，
7.1.3 量筒：500，50mL
7.1.4 刻度吸管10mL
7.1.5 带帽的小瓶2 dram
7.1.6 注射器，100μl,25μl(Reodyne)
7.1.7 Luer—注射器，5mL(一次性的)
7.1.8 巴斯德吸管
7.2 仪器
7.2.1 均质器
7.2.2 离心机（Mistral 6L Set to 4-5℃）
7.2.3 保温干冰盒
7.2.4 Bond-Elut 贮液器，25ml
7.2.5 Bond-Elut连结头（Jones Chromatography）
7.2.6 Bond-Elut净化柱，Amino(NH2)and cation exchang(scx)(500mg/2.8ml capacity)
7.2.7 带0.45μm 滤膜的过滤装置。（Millipore-waters
7.2.8 45-50℃水浴。
7.2.9 SPE-ED Mate 30 真空装置（Lab Impex Ltd）
7.2.10 氮气吹扫歧管
7.2.11 HPLC仪器
waters 4 U C18 Novapak Colum (15X0.46cm)分析柱,LC-18保护小柱,2cm（supelco）,Rheodyne 进样器（7125）配20 μl针环,紫外检测器波长266nm。

8 样品和制样步骤
有关要求引自ISO 文件78/2-1982 6.3.1节,及2052/VI/84-EN附录II。
8.1 样品性质,样品应符合64/443/EEC指令中测定肉中药物残留的要求。检测药物残留的样品中不能含有生物体液和粪便。
8.2 样品量,样品量应满足测定方法及复验所需量的要求。
在本测定磺胺的方法中，样品量不能少于20g肾。

9. 操作步骤
9.1 取2.5g 解冻和绞碎的样品于30m L试管中
9.2 加入6mL 0.1mol/L 醋酸，丙酮混合液（1：1V/V）及 12mL 乙 酸乙酯,均质1分钟,在2500rpm离心15分钟。
9.3 转移上清液于另一30mL试管中，并对样品残渣重复9.2步骤，合并上清液，并将试管放入试管架上。
9.4 将试管架放入cardice box 直到水层完全冷冻。（至少15分钟）。
9.5 倾出乙酸乙酯到另30 ml试管中，准备净化。
9.6 使用真空装置，用1柱体积的正己烷冲洗，准备NH2 Bond Elut Column。准备SCX柱，用1柱体积的正已烷洗，接着用两柱体积的5%醋酸/乙酸乙酯冲洗。（ 不能让SCX柱流干）通过Bond-Elut连接头组合两个柱子。
9.7 转移乙酸乙酯提取物于柱上贮液器，通过真空泵抽吸使其过柱。
9.8 用2柱体积的甲醇冲洗该柱（每次6ml）
9.9 关闭真空阀门，卸下NH2柱和柱上贮液器。
9.10 用2柱体积的水冲洗SCX柱，接着用4柱体积的甲醇冲洗，（ 不能让SCX柱流干）
9.11 从装置上移去柱子，接到 Luer Syringe并用3mL 25%氨/甲醇在正压下洗脱磺胺二甲嘧啶于2 dram via1中。
9.12 在N2气流下，45-50℃水浴上浑干洗脱液。用0.5mL丙酮溶解残留物，然后以巴斯德吸管转移至另一小瓶中，再用0.5mL 丙酮冲洗，合并冲洗液。需要时，洗脱液可在-20℃放置过夜。
9.13 挥发至干，并用200μL 丙酮重新溶解，取100μL挥发，用500uL 流动相重新溶解用于HPLC测定。
9.14 HPLC在室温下运行，在开始分析之前，通过运行流动相，以1mL/min 流速运行均90分钟来平衡体系。
9.15 进样20μL每一种预先用洗动相制备的HPLC 标准溶液来校准体系。
9.16 进样分析溶于流动相中的提取物，每进样5个样品运行一个标准工作液。分析一个样品约需12分钟，磺胺二甲嘧啶的保留时间约为7分钟。
9.17 如果发现样品中的色谱峰的保留时间与标准品相似，混合相等体积的合适的标准溶液和样品液，分析该混合物，以检查重叠的色谱峰。
9.18 最后一针进样完毕后，让甲醇以0.2mL/min流速通过系统过夜。如果不使用时，在柱内注入甲醇。

10. 结果计算
以峰高对浓度建立校正曲线，曲线范围：5—30ng磺胺二甲嘧啶。
磺胺二甲嘧啶通过进样样品的峰高定量计算，然后进行进样体积和样品添加平均百分回收率校正,结果以mg/kg(ppm)表示,20μL样品进样量相当于0.05g样品。

76检出的磺胺二甲嘧啶量
% 回收率 = --------------------------- ×100
添加的磺胺二甲嘧啶量

ng磺胺二甲嘧啶（从校正曲线得出） 1 100
磺胺二甲嘧啶在样品中的浓度（mg/kg） = ---------------------------------- × ----- ×--------
1000 0.05 %回收率

对于样品中含有的磺胺二甲嘧啶的浓度超出了校正曲线范围时，则对提取物进行稀释后再进行色谱分析。同时进行适当的体积校正。
灵敏度：
该方法对磺胺二甲嘧啶的检出限是0.01mg/kg，添加0.1mg/kg磺胺的回收率超过80%。

11. 特殊事例

12. 方法注意点

13. 质量控制
分析11个组织样品，加入一个质量控制样品和2个空白添加样品是适合的。
* 质量控制样品从预先分析过的，并且发现含有超过最大残留限量的(MRL)的磺胺二甲嘧啶的样品中获取。
** 空白样品从预先分析过的并未检出磺胺二甲嘧啶的样品中获取。用100μL 2.5 μg/mL的磺胺二甲嘧啶标准溶液进行添加。

14. 检测报告

15. 缩略语
见手册12节，附录I中缩写。

16. 流程图
肾 酸化的乙酸乙酯 冷冻 倾出 乙酸乙酯提取液

NH2-BOND-ELUT 柱 洗脱 SCX-BOND-ELUT 柱 洗脱

氨/甲醇 挥干 HPLC流动相溶解 HPLC 计算结果