仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >认证认可专区 > 管理体系认证 > 帖子详情

【分享】欧盟兽药检测方法（之八）

一道黑

2008/11/26

管理体系认证

动物毛发、尿液及组织中克喘素(盐酸克仑特罗)及舒喘宁(沙丁胺醇)残留量的测定
(香港政府化验所)

Determination of Clenbuterol and Salbutamol
in Animal Hair, Urine and Tissues
(Hong Kong Govemment Laboratiry)

安全注意事项：本测定方法使用了易燃及有毒化学物质。当使用这些化学试剂时，应按照政府化验所安全手册描述的注意事项进行操作。
如使用手套，防护眼镜在通风柜内进行操作等。
1 简介
1.1 本方法适用于检验动物毛发尿液及组织中克喘及舒喘宁的测定。组织和尿液样品用盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶在PH=5.2的缓冲溶液中消化。萃取的组织样液通过离心和过滤分离。尿液和毛发样品命名用有机溶剂萃取。所有萃取液均用固相萃取净化，分离的药物残留经守双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后用带有质量选择检测器的气相色谱仪测定。
2 试剂
2.1乙酸铵缓冲液(20Mm，PH=5.2)、溶解1.45g乙酸溶于500～700ml水中，用乙酸调整PH值为5.2并稀释到1升。
2.2 -盐酸葡萄糖醛甙酶/芳基硫酯酶溶液30U/ml或相当者。
2.3 十二烷基磺酸钠(SDS)：1%，采取10g 溶于1L蒸馏水中。
2.4 30mM盐酸:稀释30ml1M盐酸到1升蒸馏水中。
2.5 甲醇：分析纯。
2.6 氨化甲醇(amonium methanol)：4%。用甲醇稀释4ml氨溶液(比重0.88)至100ml。
2.7 BSTFA.
2.8 甲苯：分析纯。
2.9 乙酸乙脂－异丙醇(6：4)：分析纯。
2.10 C18小柱：supelclean LC-18Sep Pak小柱500mg,3ml。
2.11 SCX小柱:supelclean,LC-SCX Sep pak小柱500mg,3ml。
2.12 标准溶液
2.12.1 储备液：1000ppm(1mg/ml)
2.12.1.1 克喘素(4-氨基- [t-丁基氨基-甲基]-3,5二氯苯基惭醇盐酸盐。
精确称取约114 mg克喘素盐(相当于100mg的克喘素)，溶解于100ml甲醇中。
2.12.1.2 舒喘宁(4-氨基- [t-丁基氨基-甲基]4-羟基-m-二甲苯- , -二醇)精确称取约100mg舒喘宁,溶解于100ml甲醇中.
2.12.2 中间溶液：30ppm(30ug/ml)分别移取3ml上述储备液(1mg/ml )定容至100ml甲醇中。
2.13.3工作溶液：0.3ppm(30ug/ml )移到1ml上述中间溶液(30ug/ml)用甲醇定容至100ml。
3 仪器设备
3.1离心瓶 50ml。
3.2 Sep-Pak真空接头。
3.3具聚四氟乙烯拧盖的试管。
3.4食品绞碎机。
3.5机械真空泵。
3.6涡旋混匀器。
3.7恒温箱，37±3℃。
3.8恒温箱，80±3℃。
3.9恒温箱，100±3℃。
3.10气相色谱仪，配质谱检测器。
4试验步骤
4.1提取
4.1.1动物组织(肉、肾脏、肝脏、肺、心脏等)。
4.1.1.1绞碎组织样品1 min。
4.1.1.2准确称取10±1.0g已绞碎的样品于50ml具拧盖的离心管中。
4.1.1.3 加放20ml20mM的乙酸缓冲溶液，均质5min。
4.1.1.4 加入50 l -盐酸葡萄糖醛甙酶溶液。
4.1.1.5 拧紧盖子，震荡、超声15min。
4.1.1.6 于37℃培养18hr.
4.1.1.7 于3000rpm离心5min，过滤上消液。
4.1.1.8 收集滤液以备净化。
4.2 尿样
4.2.1 用移液管移取5ml尿样于50ml具拧盖的离心管中。
4.2.2 用乙酸调整PH值至5.2。
4.2.3 加入1ml20Mm的乙酸铵缓冲溶液。
4.2.4 加入50 m盐酸葡萄粮醛甙酶溶液。
4.2.5 拧紧盖子，震荡、超声15min。
4.2.6 于37℃培养18hr。
4.2.7 加入10ml乙酸乙酯－异丙醇混合液，震荡15min。
4.2.8 用滴管收集有机相。
4.2.9 用10ml上述混合液重复提取一次。
4.2.10 合并两次提取的溶液于一玻璃试管中。
4.2.11 用氮气吹干。
4.2.12 用1ml20mM的乙酸铵缓冲溶液溶解。
4.3 毛发样品
4.3.1 取约1g毛发至－500ml烧，ml%SOS溶液冲洗。
4.3.2 搅拌上述溶液30min，使之分散。
4.3.3 再用100ml1SDS 溶液冲先一次。
4.3.4 用蒸馏水清洗毛发样品，去除SDS溶液。
4.3.5 于40℃的烘箱中烘干样品。
4.3.6 切碎毛发。
4.3.7 准确称取500mg毛发样品于具拧盖的试管事。
4.3.8 加入10ml甲醇，超起30min。
4.3.9 拧紧盖子在60℃的烘箱中加热2hr，并不时震荡。
4.3.10 离心甲醇提取液。
4.3.11 再用10ml甲醇提取一次，在60℃的烘箱中加热1hr。
4.3.12 合并两次甲醇提取液。
4.3.13 用氮气吹干。
4.3.14 用1ml20mM的乙酸胺缓冲溶液溶解。
4.4 净化
4.4.1 装好真空泵和接管，将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5ml甲醇、5ml水和5ml30Mm盐酸活化。
4.4.2 取5ml滤液(4.1.1.8)至C18柱中。
4.4.3 对于尿和毛发样品，移取1ml所得溶液(4.2.1.2或4.3.1.4)C18至柱中。和1Ml20Mm的乙酸胺缓冲溶液冲洗试管并一起转移至C18柱中。
4.4.4 依次用5ml水、5ml甲醇淋洗柱子。
4.4.5 在溶剂流过固相萃取柱后，保持抽气5min使柱中的液体逐渐枯竭。
4.4.6 取下C18柱。
4.4.7 用5ml4%氨化甲醇(2.6 )淋洗SCX柱并收集流出液于具塞玻璃试管中。
4.5 衍生化、检测
4.5.1 用氮气吹干上述流出液。
4.5.2 用100 L甲苯溶解残渣。
4.5.3 加入100 L BSTFA，加盖并于涡旋混匀器上混匀。
4.5.4 在80℃的烘箱中加热1hr。
4.5.5 蒸干多余的溶剂。
4.5.6 用0.5ml甲苯溶解。
4.5.7 用气－质联用仪选择离子监测方式检测。
4.6 气－质联用仪参数(HP6890配5973或相当者)。
4.6.1 气相色谱仪参数(仅供参考)。
色谱柱： HP-5MS5%苯基甲基聚硅氧烷，30m，
0.25 m, 250 m;
进样口： 220℃
进样方式：不分流
进样体积： 2 m：
柱头压(700C)： 7.6psi
柱温：700C(保持6min)
以25℃/min升温至280℃(保持5min)：
流速：0.9ml/min(恒流)。
4.6.2 质谱贪多参数(仅供参考)
接口温度：280℃；
溶剂延迟：8min；
EM电压：高于调谐电压(～1500)200；
离子源温度：2300C；
四级桂温度：1060C.
4.6.3 选择离子监测程序(仅供参考)
时间目标物监测离子
8：00 克喘素 86，243，262，277
11：55 舒喘宁 86，147，207，369
5 计算及结果表述
5.1 结果表述
5.1.1 两种－兴奋剂类药物的定性是通过比较保留时间和栓测样品的Q值(Q值为标样和样品的谱图的相似性)来完成。
5.1.2 与樯样的保留时间之差不多于3秒。
5.2 Q值应大于80，当Q值小于80时，应通过人工比较选择离子的丰度，以基峰百分数表示。
5.3 计算
分别计算两种－兴奋剂的浓度
(组织和毛发用 g/1表示)
＝(A/B)*C2*M
其中 A＝样品峰面积；
B＝标准峰面积；
C2＝标样浓度 m/kg;
M=放大倍数(因子);
=(Vf / Vc)＊Vt (1/)＊D
(仅用于组织样品)；
其中Vf＝用于GC/MS测定的最终定容体积：
Vc＝用于净化的萃取液体积：
Vt ＝萃取液校正体积：
＝萃取缓冲液体和样品含水量(样重＊水份百分数)；
D＝稀释因子，如果有的话：
W＝样重，克；
M＝(Vf / V)＊D适用于毛发和尿样品)；
式中Vf－用于GC/MS测定的最终定容体积：
W－毛发样品的重量，以克为单位；或尿样的体积，以毫升为单位。
用下列含水理计算萃取液的校正体积(缓冲液体积)，只适用于组织样品。如果某组织的含水量未知，则需按通常的实验步骤单独测定。
一些常见动物组织的含水量
组织含水量(%)
鸡肉 67
生猪肉 57
生牛肉 55
猪肾 80
羊肝 70
6. 质量控制参数
6.1 两个－兴奋剂的栓测限为0.5 g/kg。
6.2 组织中克喘素和舒喘宁的平均回收分别为75.5±12.8%和72.8%±18.3%。
7. 参考文献(略)。

相关话题

yuduoling

第1楼2008/11/26

不错的资料，要是作为附件放在一个贴子里供下载就更好了．多谢分享

0

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...