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N-乙酰半胱氨酸对内质网应激介导的HepG2细胞凋亡的作用
刘芸野 谢青 王晖 林兰意 姜山 周霞秋 俞红 郭清




【摘要】 目的 了解N-乙酰半胱氨酸（NAC）对内质网氧化应激介导的肝细胞凋亡的阻抑作用， 探讨其治疗肝细胞损伤的作用机制。 方法 用过氧化氢（H2O2）诱导HepG2细胞，建立内质网氧化应激凋亡模型，用NAC进行干预。通过四甲基偶氮唑盐、DNA梯度分析、Western blot、流式细胞仪检测细胞凋亡率及活性氧（ROS）的产生等方法，了解NAC对H2O2诱导HepG2细胞的凋亡率、凋亡信号蛋白的表达以及ROS产生的影响。 结果 用不同浓度H2O2（0、1、3、5mmol/L）诱导HepG2细胞6h后，发现随着H2O2浓度增加，细胞活力下降，凋亡率增加，分别为0.7%±0.5%、26.4%±1.8%、29.7%±1.2%、51.2%±9.4%；细胞凋亡信号蛋白表达增加，ROS产生增多，分别为14.0%±0.5%、95.2%±0.1%、97.5%±0.2%、98.3%±0.2%；在3mmol/L时出现典型内质网氧化应激凋亡形态学改变。用NAC（10、20mmol/L）干预后发现，NAC可明显提高细胞活力、细胞凋亡率由29.7%±1.2%降至23.3%±4.7%和14.3%±1.2%，细胞凋亡过程中凋亡信号蛋白的表达减少、细胞内ROS的产生率由97.5%±0.2%降至52.2%±0.8%和51.2%±2.9%。 结论 NAC能对氧自由基反应有直接抑制作用，阻断内质网氧化应激介导的肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤。

【关键词】 乙酰半胱氨酸； 内质网； 细胞凋亡； 活性氧



The effect of N-acetyl-L-cysteine on endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis of HepG2 cells LIU Yun-ye, XIE Qing, WANG Hui, LIN Lan-yi, JIANG Shan, ZHOU Xia-qiu, YU Hong, GUO Qing. Department of Infectious Diseases, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University Medical School, Shanghai 200025, China

Corresponding author: XIE Qing, Email: xieqingrj@ yahoo.com.cn

【Abstract】 Objectives To analyze the mechanisms of NAC on endoplasmic reticulum (ER) stress mediated cells apoptosis of HepG2 cells and to evaluate the potential role of NAC in the treatment of liver injury. Methods HepG2 cells were treated with H2O2 to make a model of oxidative ER stress mediated apoptosis. To evaluate the apoptosis, various methods such as MTT, DNA ladder, Western blot and flow cytometry were used. Then the optimal dosage and incubution time of NAC intervention in apoptosis were ascertained, and the differences between induction and intervention of apoptosis, including the percentage of apoptosis, the expression of apoptotic protein (GRP78, Caspase-12, PARP) and the production of reactive oxygen species (ROS) were compared. Results The activity of the cells decreased by H2O2 (0, 1, 3, 5 mmol/L) treatments in a dose-dependent manner. The ratio of apoptotic cells increased (0.7%±0.5%, 26.4%±1.8%, 29.7%±1.2% and 51.2%±9.4%, respectively) as did the production of ROS (14.0%±0.5%, 95.2%±0.1%, 97.5%±0.2% and 98.3%±0.2%, respectively). The HepG2 cells showed typical morphologic change of ER stress 6 hr after they were treated with 3 mmol/L H2O2. ER stress mediated-apoptosis was confirmed by Western blot. NAC (10 mmol/L and 20 mmol/L) protected cells from apoptosis. Typical features of ER stress apoptosis were seen accompanied by diminishing the ratio of apoptotic cells from 29.7%±1.2% to 23.3%±4.7% and 14.3%±1.2%. The production of ROS also decreased from 97.5%±0.2% to 52.2%±0.8% and 51.2%±2.9%. The effect was related to the concentration: 20 mmol/L NAC was more effective than 10 mmol/L. Conclusions As an oxidizing agent, H2O2 may induce ROS in cells and induce oxidative stress, causing ER stress and apoptosis. NAC can inhibit the procession of ROS directly and prevent injuries to the hepatocytes.

【Key words】 Acetylcysteine; Endoplasmic reticulum; Apoptosis; Reactive oxygen species

死亡受体活化和线粒体损伤是已证实的两条经典的凋亡信号传导途径。内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激是一条新的凋亡信号传导途径。多种肝脏疾病的发病机制与ER应激引起的肝细胞损伤有关，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）是触发肝细胞发生ER氧化应激引起凋亡的因素之一。我们采用细胞生物学和分子生物学的方法，探讨N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）对ER氧化应激介导的肝细胞凋亡的阻抑作用。

材料与方法

一、材料

1. 主要试剂和仪器：（1）HepG2细胞株，由长征医院惠赠。（2）主要试剂和仪器：30%过氧化氢（H2O2）购于德国MERCK公司，NAC、双氢罗丹明购于美国Sigma公司，流式细胞仪检测试剂盒购于美国Amersham Biosciences公司，半胱天冬氨酸蛋白酶Caspase-12抗体及内质网伴侣蛋白GRP78抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，ADP多聚酶抗体购于美国Cell signaling公司。流式细胞仪为美国FACScalibur BD公司产品，Western blot装置为美国BIO-RAD公司产品。

2．方法：（1）细胞培养：HepG2细胞株于含10%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养液中，在37℃，5% CO2孵育箱中培养。（2）H2O2诱导HepG2细胞凋亡模型的建立：吸去培养皿中原细胞培养上清液，加入含不同终浓度H2O2（0、1、3、5mmol/L）的DMEM培养液（含10%胎牛血清及1%青链霉素），置37℃，5% CO2条件下培养6h后收集细胞。（3）NAC干预HepG2细胞凋亡：吸去培养皿中原细胞培养上清液，在DMEM培养液中加H2O2至终浓度0、1、3、5mmol/L，并加NAC至终浓度为10mmol/L或20mmol/L，置37℃，5% CO2孵育6h后收集细胞。（4）四甲基偶氮唑盐检测细胞活力：96孔板每孔加5g/L的四甲基偶氮唑盐溶液10～20μl，置37℃，5% CO2条件下孵育4h后，弃细胞培养上清液，每孔加二甲基亚砜100μl，振荡10min，测492nm波长的吸光度值。（5）流式细胞仪检测凋亡率：6孔培养板中，胰酶消化贴壁细胞，分别收集经H2O2或NAC处理的细胞悬液［每管细胞约（0.8～1）×105个］，操作步骤按流式细胞仪检测试剂盒说明书进行。（6）DNA梯度分析：刮取并收集培养板中细胞， 按说明书操作步骤抽提DNA。取40μg DNA上样，20g/L琼脂糖加5μg/ml溴化乙锭上色凝胶电泳，凝胶处理系统成像。（7）蛋白质抽提，浓度测定及Western blot检测凋亡蛋白表达：①蛋白质抽提及浓度测定：在4℃下刮取并收集10cm培养皿内的细胞，经离心后在细胞沉淀中加细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，抽提蛋白质，检测蛋白质浓度。②Western blot：取蛋白样本40μg与上样缓冲液混匀至20μl，上样，经电泳，转膜，封闭非特异性位点，第一抗体Caspase-12（1∶1000）、GRP78（1∶500）、ADP多聚酶（1∶1000）、β-肌动蛋白(1∶10000)孵育，4℃过夜。洗膜后用辣根过氧化物酶标记的第二抗体（1∶2000）孵育1h。强化化学发光法显色， X线自显影系统冲洗，胶片在电脑扫描仪上扫描图像并分析处理，以β-肌动蛋白作为内参照。（8）流式细胞仪检测ROS：在24孔板中加含终浓度10μmol/L 双氢罗丹明的培养液，37℃，5% CO2条件下孵育细胞6h（不加双氢罗丹明为空白对照，未经凋亡诱导的正常细胞加双氢罗丹明为阴性对照)。消化贴壁细胞并收集细胞沉淀，磷酸盐缓冲液洗涤1次，上机检测，激发光为488nm亚离子激光。

结 果

1. NAC对HepG2细胞生长的影响：H2O2 1mmol/L诱导6h时细胞开始出现形态学改变，由正常的贴壁多边形开始出现收缩、变圆，胞浆内出现空泡，3mmol/L时最明显，5mmol/L开始有较多细胞死亡脱落。随着H2O2浓度增加，细胞活力逐渐下降，有明显的浓度效应关系。分别用10mmol/L或20mmol/L NAC和不同浓度的H2O2共同孵育HepG2细胞6h，发现NAC可提高在H2O2诱导下HepG2细胞的活力，且随NAC浓度增加而逐渐明显，NAC 20mmol/L时细胞活力最高，见图1。

2. NAC对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡的影响：用不同浓度H2O2（0、1、3、5mmol/L）诱导HepG2细胞6h，以Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶荧光素联合标记，流式细胞仪检测凋亡率，发现随H2O2浓度增加，细胞早期凋亡率逐渐升高，分别为0.7%±0.5%、26.4%±1.8%、29.7%±1.2%、51.2%±9.4%，t＝2.45，P<0.05，差异有统计学意义，见图2。用NAC（10、20mmol/L）与3mmol/L H2O2共孵育细胞，凋亡率由单独用3mmol/L H2O2诱导6h时的29.7%±1.2%降至23.3%±4.7%和14.3±1.2%，t＝2.09，P<0.05，差异有统计学意义，见图3。细胞凋亡晚期染色质DNA被降解为180～200bp整倍数的寡核苷酸片段，DNA凝胶电泳呈现为特征性的“梯形条带”。本研究发现用3、5mmol/L H2O2诱导HepG2细胞6h出现明显的梯度改变，将NAC（10、20mmol/L）与3mmol/L H2O2共同孵育HepG2细胞6h后，DNA梯度分析发现凋亡条带消失。说明NAC可阻止H2O2作用下细胞凋亡的发生，且随着NAC浓度的增加，凋亡率下降越明显。

3. NAC对H2O2诱导的HepG2细胞凋亡信号蛋白表达的影响：随着H2O2浓度增加，内质网分子伴侣GRP78的表达量逐步增加，5mmol/L时达高峰，用NAC 10mmol/L干预后，表达量有所下降，20mmol/L时进一步下降。而ER应激的特异性标志Caspase-12逐步被裂解活化而表达降低，用NAC干预后，酶原表达逐渐恢复。而ADP多聚酶的表达随凋亡的加重，活化片段逐渐增加，用NAC干预后，活化片段逐渐减少，见图4。

4. NAC对ROS生成的影响：不同浓度H2O2 （0、1、3、5mmol/L）诱导HepG2细胞6h后发现，可测到ROS的HepG2细胞平均比例分别为14.0%±0.5%、95.2%±0.1%、97.5%±0.2%、98.3%±0.2%，提示随着H2O2浓度升高，细胞内ROS的生成也逐渐增加。将NAC（10、20mmol/L）与3mmol/L H2O2共同孵育HepG2细胞6h后，检测ROS时发现，产生ROS的细胞平均比例由单独用3mmol/L H2O2诱导6h时的97.5%±0.2%降至52.2%±0.8%与51.2%±2.9%，说明NAC能部分抑制由H2O2诱导产生的ROS，t＝2.80，P<0.05, 差异有统计学意义。

讨 论

NAC能刺激谷胱甘肽合成，增强谷胱甘肽S转移酶的活性，尽管人们认为NAC保护肝细胞的作用主要是促进解毒以及对氧自由基反应的直接抑制，从而减轻肝脏损伤，但对NAC抑制肝细胞凋亡的作用机制目前尚未完全了解。本研究采用H2O2诱导HepG2细胞产生ROS，介导ER氧化应激引起的肝细胞凋亡，探讨NAC对ER氧化应激介导的HepG2细胞凋亡的阻抑作用。

最近的研究证实，非酒精性脂肪肝、胆汁淤积和酒精性肝病、HBV和HCV感染等肝脏疾病的发病机制均与ER应激引起的损伤有关[1]。多种因素如缺血缺氧、缺乏生长因子、钙失衡、自由基及药物等可引起内质网应激，其中ROS所致的氧化应激与ER介导的肝细胞凋亡途径密切相关。研究表明，金属离子、细胞内谷胱甘肽的耗竭、生长因子的缺乏、细菌或病毒感染以及一些物质的氧化代谢均能促进ROS的生成。ROS包括：过氧化氢（H2O2），羟自由基（OH），超氧阴离子（O22-）。人体内ROS主要来源于线粒体，ER与溶酶体也能产生ROS[2]。线粒体、膜脂质、蛋白、核基因、均可成为ROS攻击的目标。ER既是ROS的重要来源之一，也是ROS攻击的重要目标之一[3]。因此活性氧的产生是导致ER发生氧化应激从而介导肝细胞凋亡的重要因素之一。

ER是蛋白质正确折叠和钙离子储存的场所。ER膜上有一种RNA倚赖的蛋白激酶样eIF-2a激酶/(PERK)，内质网分子伴侣GRP78结合于PERK上，抑制其磷酸化。在ROS的作用下一方面ER腔内蛋白质被氧化修饰，使ER腔内错误折叠和非折叠蛋白积聚，发生非折叠蛋白反应，此时GRP78则从PERK上解离而改为与非折叠蛋白结合，失去GRP78的PERK则发生磷酸化。磷酸化的PERK使eIF-2a发生磷酸化，继而活化下游Caspase-12酶原从而导致凋亡[4]。Caspase-12酶原主要存在于ER，ER损伤可特异性地使其活化，使Caspase-12酶原(约60×103)被切割形成活化的Caspase-12(约12×103)，非ER应激的凋亡途径不引起Caspase-12活化[5]。另一方面细胞内氧自由基增加，三磷酸腺苷大量消耗，可使ER的钙通道失活，造成ER腔内钙离子释放至胞浆，使细胞内钙离子失衡[6]，最终导致凋亡[7，8]。

NAC作为巯基合成的前体，能对氧自由基反应有直接抑制作用，从而抑制凋亡[9]。本研究结合国内外报道及已有的工作基础，采用了不同浓度的H2O2诱导HepG2细胞6h，建立ER氧化应激凋亡模型。动态观察发现在光学显微镜下贴壁细胞凋亡表现为皱缩、变圆，胞浆内出现空泡和细胞脱落, 随后出现细胞凋亡、坏死。随着H2O2浓度的增加， 细胞活力逐步下降；流式细胞仪检测发现细胞凋亡率逐渐增加；3mmol/L时细胞呈明显的凋亡形态改变，DNA电泳显示出典型的凋亡片段；DHR被泵入线粒体内后，被细胞内ROS所氧化，从而维系在细胞内，经过一定时间的累积，即可通过流式细胞仪检出相应的荧光。本研究用流式细胞仪检测细胞内ROS在H2O2作用下产量增加，NAC干预后产量下降；H2O2作为一种强氧化剂使细胞产生大量ROS，以往人们多关注于其干扰线粒体氧化呼吸链，参与线粒体途径凋亡。本研究采用Western blot检测发现，H2O2诱导HepG2细胞凋亡过程中伴随有ER的分子伴侣GRP78表达的增加，ER应激特异关键性蛋白酶Caspase-12的活化，以及ADP多聚酶的降解。提示H2O2所致的HepG2细胞凋亡与内质网应激介导的凋亡信号通路密切相关。用NAC干预后发现，细胞活力逐步升高、DNA凋亡片段消失、 ROS的产生减少、凋亡信号蛋白表达降低。由此，NAC能抑制ROS的产生，从而抑制内质网氧化应激介导的HepG2细胞凋亡的发生。这一研究结果为临床上NAC治疗各种肝脏疾病，阻止肝脏损伤提供一定的理论基础。

参 考 文 献

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应助达人

没有英文版的吧？

在ncbi上面搜索结果显示的是中文！

那我如何看到文憲結果裡面那些圖片呢....><
在NCBI上的應該都有全文才對 我也不太清楚
真傷腦筋.....