【分享】激光共聚焦扫描显微镜基础

概念：激光共聚焦扫描显微镜就是激光源加共聚焦显微镜，具体说就是利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。

LSCM的主要组成部分及工作原理：




illuminating pinhole:照明针孔

功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。

beamsplitter:光束分离器

功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。

Objective:物镜

功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及 detector pinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。

detector pinhole:探测器针孔

功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。

PMT：光电倍增管（探测器）

功能：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。



激光器：图中未示。共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。我们可以根据研究需要选择不同的激光器。如ArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm)Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等。
多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。

经过对LSCM的各组成部分了解之后，其工作原理不难理解。即：点光源照射样品产生的激发光斑被探测器以共扼的形式接收于焦平面，计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上。为产生一幅完整图象，可通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动，以实现在同一焦平面上的逐点扫描。同样，也可以通过沿Z轴方向逐渐改变焦平面，来完成对样品不同层面的扫描。亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片，连续光学切片经过计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构

LSCM相对光学显微镜的优点：

（1）：LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理：（2）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；（3）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径：（4）LSCM除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复技术等。

主要技术指标：

1）：xy分辨率：Rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜Rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁^（）。

2）：待测样品最大厚度：约1-2mm.

3）：样品最小光切厚度：40nm

4）：Z轴最大分辨率：0.35um.

5）：扫描速度：slow：单向：220lines/s 512x512 2-3秒 双向：440lines/s

medium：单向：450 lines/s 512x512 1.7秒 双向：900 lines/s

fast：单向：1000 lines/s 512x512 0.7秒 双向：2000 lines/s

赞！原来共聚焦是共轭聚焦的意思啊，真的是解惑了！

冬季巡视全面发展啊~

不知现在应用得多不多?

谢谢分享哦。激光共聚焦显微镜用处挺大的，生物和材料领域比较有需求。我们有台莱卡的