初学者&九点虎
第1楼2009/04/15
(二)碘量法
方法原理:如果牛奶中含有β-内酰胺酶,β-内酰胺酶分解青霉素后产生的青霉噻唑酸与淀粉竞争游离碘,破坏了碘与淀粉的蓝色复合物,使蓝色变为无色,从而判断牛奶中是否掺有抗生素分解酶。
实验步骤:取1 ml 牛奶于一小试管中,加入不同浓度β-内酰胺酶溶液,加入250 ppm青霉素V钾磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾8.0g,蒸馏水定容至1L,在115℃灭菌30分钟)40 μl,在37℃水浴中放置30分钟,不时摇动,加入1%淀粉溶液500 μl,摇匀,加入碘液(碘化钾20g,碘5g,蒸馏水定容至250ml )20 μl,在37℃水浴中放置2分钟观察结果。同时做空白对照实验。
结果判定:在2分钟内能使蓝色完全消退的为β-内酰胺酶阳性,不消退者为阴性。即蓝色为阴性,白色为阳性。
讨论:碘量法作为快速筛选方法,每次实验均需要阳性和阴性对照;对反应时间等条件要求较严格,否则容易造成误判;不同牛奶样品实验现象差别较大,还需进一步研究。
二、 微生物方法
1 材料
1.1 菌株 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001购自国家医学菌种保藏管理中心,在营养琼脂上传代培养备用。
1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ(低PH)购自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯(外径8mm)
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ(含1×108CFU/ml藤黄微球菌)。
2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析
将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面,其中3片纸上滴加20ul不同稀释度的抗生素分解剂(500万U/ml,50万U/ml,5万U/ml),同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.3 青霉素G浓度的选择
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度(0IU/ml,0.005IU/ml,0.05IU/ml,0.5IU/ml,5IU/ml)青霉素G的生理盐水,37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径,以确定青霉素G使用浓度。
2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度(0U/ml,4U/ml,40U/ml,400U/ml,50万U/ml,75万U/ml,125万U/ml,250万U/ml)β-内酰胺酶的生理盐水,37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶(0U/ml,4U/ml,40U/ml,200U/ml,300U/ml,400U/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响
使用10%(w/v)脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。
2.1.7 舒巴坦浓度的选择(未完成,实验参数待验证)
有实验表明,在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现,含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈;含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦(0ug/ml,100ug/ml,200ug/ml,400ug/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈,以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度(~0.5ug/ml)和舒巴坦最高适用浓度(~200ug/ml)确定的基础上,在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶(高于推荐使用浓度100倍)和不同浓度舒巴坦(0ug/ml,25ug/ml,50ug/ml,100ug/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况,以确定舒巴坦最终适用浓度。
2.1.8 脱脂奶中β-内酰胺酶的测定(未完成,实验参数待验证)
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表1),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。
表1
编号 0.5ug/ml青霉素G 400U/mlβ-内酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 结果预测
(是否产生抑菌圈)
1 + - - 有
2 + - + 有
3 + + - 无
4 + + + 有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表1),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。
2.1.9 β-内酰胺酶检测限的测定(未完成)
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素、25ug/ml舒巴坦和不同浓度β-内酰胺酶(0.4U/ml,4U/ml,40U/ml,400U/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。
2.2 牛奶样品中β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表2),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。同时做脱脂奶中β-内酰胺酶的测定。
表2
编号 0.5ug/ml青霉素G 400U/mlβ-内酰胺酶 25ug/ml舒巴坦 抑菌圈 与1号比直径差异 结果预测
1 + - - 有
2 + - + 有 ≥3mm
≤3mm 含β-内酰胺酶
不含β-内酰胺酶
3 + + - 无
4 + + + 有
5 - - + 无
6 - - - 有/无 含抗生素/不含抗生素
3 实验结果与分析
3.1 预实验结果与分析
3.1.1 生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析
第一次实验 10天后第二次实验 青霉素对照
第一次实验5万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素,与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小;50万U/ml抗生素分解剂可以完全分解青霉素,不产生抑菌圈。
10天后第二次实验50万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素,与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小。
第一次实验和第二次实验结果比较,抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。
3.1.2 青霉素G浓度的选择
0.5IU/ml青霉素产生抑菌圈约为22mm,符合实验要求。
3.1.3 β-内酰胺酶对菌生长的影响
极高浓度β-内酰胺酶不影响菌生长。
3.1.4 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
第一次实验结果 10天后第二次实验结果
第一次实验中,4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml青霉素,与对照组比较抑菌圈明显减小。
10天后第二次实验,200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml青霉素,与对照组比较抑菌圈明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。
通过第一次实验和第二次实验结果比较,说明抗生素分解剂活性下降。