【讨论】请教关于1D-SDS PAGE+RP LC+MS/MS的一系列问题

coffee424907

2009/09/01

私聊

电泳仪

最近在做1D-SDS PAGE+RP LC+MS/MS，有些问题没整明白：
1-1D-SDS PAGE
1.1 一般用于LC-MS/MS的一维胶上样量大致在什么范围，我看有的文献就上样10微克？关于上样量的多少，需要做完整的PAGE+LC+MS/MS实验流程来看对比效果，最终决定上样量吗？
1.2 考染后切胶时，是按均匀宽度切胶还是根据胶条呈色深浅决定胶条宽度（深色切窄些，浅色切宽些）？
2 RP LC
2.1在色谱上样前一般怎么处理？我是在酶切、冷冻干燥后，得到回收酶切产物，用Loading Buffer溶解酶切产物，3000rpm离心（这个速度足够分离肽段和杂质吗？），取上清（但是一般观察不到沉淀），不知是否有更好的办法？
2.2我按2.1操作后上样，用的柱子是75微米内径、15厘米长、C18、3微米、100埃的RP柱（在RP柱之前有一个2微米的过滤器和一个trap柱），进行样品分析时总是频繁的堵（最长坚持了十几小时，最短的就2、3小时），流动相中水经过0.22微米过滤，有机相用的是Merck原装进口的，我自己估计问题还是在样品方面，不知各位有何建议？

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ericson114

第1楼2009/09/02

上样量多少应该由你的实验目的决定。。比如你是想利用SDS-PAGE进行大规模的分级，然后鉴定尽可能多的蛋白，那么就能多上点就多上点，毫克级都没问题；如果你就想鉴定某一个条带是什么蛋白，那么就根据那个蛋白的表达量适度上样，基本上条带肉眼可见就行，这和考染的灵敏度有关系。。

一般是根据条带的深浅决定的，条带深就切少点，条带浅就切宽点。。

我们一般也这么做，但是离心速度可以更高一些，10000RPM，为了出去一些细小的胶颗粒，不用担心肽段损失。。

coffee424907 发表:最近在做1D-SDS PAGE+RP LC+MS/MS，有些问题没整明白：
1-1D-SDS PAGE
1.1 一般用于LC-MS/MS的一维胶上样量大致在什么范围，我看有的文献就上样10微克？关于上样量的多少，需要做完整的PAGE+LC+MS/MS实验流程来看对比效果，最终决定上样量吗？
1.2 考染后切胶时，是按均匀宽度切胶还是根据胶条呈色深浅决定胶条宽度（深色切窄些，浅色切宽些）？
2 RP LC
2.1在色谱上样前一般怎么处理？我是在酶切、冷冻干燥后，得到回收酶切产物，用Loading Buffer溶解酶切产物，3000rpm离心（这个速度足够分离肽段和杂质吗？），取上清（但是一般观察不到沉淀），不知是否有更好的办法？
2.2我按2.1操作后上样，用的柱子是75微米内径、15厘米长、C18、3微米、100埃的RP柱（在RP柱之前有一个2微米的过滤器和一个trap柱），进行样品分析时总是频繁的堵（最长坚持了十几小时，最短的就2、3小时），流动相中水经过0.22微米过滤，有机相用的是Merck原装进口的，我自己估计问题还是在样品方面，不知各位有何建议？

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coffee424907

第2楼2009/09/02

非常感谢，实在太有用了
ericson114 发表:上样量多少应该由你的实验目的决定。。比如你是想利用SDS-PAGE进行大规模的分级，然后鉴定尽可能多的蛋白，那么就能多上点就多上点，毫克级都没问题；如果你就想鉴定某一个条带是什么蛋白，那么就根据那个蛋白的表达量适度上样，基本上条带肉眼可见就行，这和考染的灵敏度有关系。。

一般是根据条带的深浅决定的，条带深就切少点，条带浅就切宽点。。

我们一般也这么做，但是离心速度可以更高一些，10000RPM，为了出去一些细小的胶颗粒，不用担心肽段损失。。