【求助】分离效果完全不能重现怎么办？

重现性不好，第一次都能做出来，您换下来的这跟柱子没有再测试其他样品吗？使用离子对试剂对柱子不好，但不会那么夸张吧，流动相的影响也是很大的，它的PH要求苛刻吗？

流动相水相比例太大,从流动相方面考虑.不管是检出物,还是流动相的缓冲盐等.可以考虑纯甲醇和5%甲醇水,的冲洗时间,调换.就是5%甲醇水2个小时,纯甲醇1个小时.效果可能更好.
另第一次分离很好,第二次完全分不开.第一次分离度多少?第二次分离效果又是多少?楼主最好贴个图出来.是不是第一次分离的时候就勉强可以分开.如果是的话,那重新配流动相等些许的条件变动,都有可能会影响其分离度

pH要求比较苛刻

把图贴上去了，再次求助

我也是感觉楼主冲洗色谱柱有点问题：
1.这是离子对缓冲剂，我估计浓度在0.02mol/L以上，离子对缓冲盐比较难冲洗，我建议5%--10%的甲醇冲洗至少一个半小时，
2.个人认为不要保存在100%的甲醇中，因为结晶析出的盐对色谱柱是个巨大的破坏，你可以保存90--95%的甲醇水中。
3.在换流动相之前，我建议先用5%的甲醇水冲洗至少30分钟，不要开始就用流动相走系统。
4.从图上看，所有的色谱峰均出现肩峰，这个可能是色谱柱或者过滤器堵住，原因估计是样品脏或者是盐析出。另外我希望楼主能够给我们说下前后两次的压力变化。
5.楼主买来色谱柱的第一件事情应该先检测理论塔板数，然后感觉色谱柱不是太好的情况下，在检测一次，比较前后塔板数区别，看看是不是差异很大。
6.用离子对试剂应该PH比较苛刻，楼主一定注意PH是在缓冲盐甲醇混合前调节还是混合后调节，我看了部分书籍，推荐是混合前调节PH，因为在有有机相的溶液中，检测的PH是不准确的。
希望我说的能够对你有所帮助。

什么分析方法啊？
水相比例这么大，pH值这么小
固定相肯定塌陷了，严重的话就报废了
好好用甲醇和异丙醇冲冲