HP$$lc/MS的应用(4) nanoHP
$$lc/nanoESI-MS联用进行蛋白质组学的研究
文章报道了一种高效(峰容量为~103)纳米级(使用内径为 15 μm 的毛细管色谱柱)的高效
液相色谱(nano
$$lc) 和小流量的电喷雾 (nanoESI) 质谱联用的仪器,使用这一仪器进行了球蛋白酶的消化液(即蛋白质组学的研究)复杂体系的分析。
选择适当的溶剂用液体匀浆法填充 87-cm 长、柱内径为 14.9~74.5 μm的色谱柱,所用填料的直径为 3 μm 的 C18 键合在多孔( 30 nm 孔径)硅胶上的固定相,使用的压力为 18 000 psi.。流动相的压力为 10 000 psi ,流速为20 nL/min,
$$lc 的线流速为 0.2 cm/s ,这一流速接进于系统的最佳分离效率的流速。
为了保持色谱系统的柱效,要把连接到 nanoESI 喷口(其直径只有 2~10 μm,具体大小决定于填充毛细管色谱柱的直径)上的连接管的直径要小到10 μm),通过 nanoESI 接口把混合四极杆飞行时间质谱和高效
液相色谱仪连接起来。当把切换阀连接到 nanoESI 阳极进样做定量分析时,Nano
$$lc 能把蛋白质水解出来的多肽混合物进行分离,其峰容量为 103。在样品量范围较大时(例如:5~100 ng ,球蛋白水解肽的量为50~500 ng 时,分别使用14.9- 和 29.7-μ m-i.d 的填充毛细管色谱柱),nano
$$lc/nano ESI MS 对低丰度复杂混合物组份的响应值是随样品量的增加而呈线性地增加,nano
$$lc/nanoESI MS 在 20-400 nL/min 流量的范围内,其灵敏度是随柱流量的减小呈线性地提高,或者大约随毛细管色谱柱内径的平方成反比关系。这样,除去在低负荷的情况下,减小分离毛细管色谱柱的内径和增加进样量的效果是一样的,这一情况对受样品量限制的蛋白质组学的应用是很重要的。
使用表面孔径为 300-Å 多孔 C18 填料相对于使用无孔填料,对多肽的回收率没有太大的影响。
也进行了使用高效 nano
$$lc 进行串联质谱的分析,实验证明是可行的。
在一支色谱柱上(用单一的 nanoESI 喷嘴)对色谱的流出时间、MS 的相应值和质谱测定的准确性进行了考察。对复杂的蛋白质组学样品使用不同的色谱柱(相同和不同的毛细管色谱柱内径连接不同的 nanoESI 喷嘴)以及不同的样品(不同的球蛋白水解液浓度)进行了研究,结果证明这一方法的耐用性和重复性和灵敏度都很好。
如要了解详细内容请阅读原文(Anal. Chem.2002, 74(16):,4235)