【原创】一种新型的重组蛋白A柱

btcputus

2009/12/02

私聊

生命科学仪器综合讨论

一种新型的重组蛋白A柱
洗脱条件温和，充分防止蛋白变性
蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将蛋白A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的蛋白A柱结合的都是天然蛋白A。天然蛋白A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图一所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然蛋白A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。

为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出蛋白A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组蛋白A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组蛋白A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的柱子结合的重组蛋白A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。虽然每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。GE的重组蛋白A柱即为这种类型，如图二所示。考虑到减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异从而使洗脱条件温和而均一，Putus研制出了含有三个串联B结合域的重组蛋白A，如图二所示。同时，我们用Putus重组蛋白A柱和GE重组蛋白A柱纯化人血浆，纯化的结果用于比较两种纯化柱的纯化效果，结果如图三所示。
GE
Putus
图二、重组蛋白A结构示意图
待纯化样品：人血浆
实验材料：
GE公司的重组蛋白A柱（E、D、A、B、C结构域串联，见图二）
Putus公司的重组蛋白A柱（3个B结构域串联，见图二）
实验方法：
分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下：

上图从左边起，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为经过GE填料洗脱后抗体，泳道3为经过Putus填料洗脱抗体，泳道4为人血浆。从图中，我们可以看出，与GE 重组蛋白A填料从人血浆纯化抗体纯度比较，拥有3个同型结构域的Putus填料可以获得同样纯度的抗体。但是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.0。由此可见，使用具备较少B结构域的重组蛋白A柱也能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，能防止蛋白质聚集，保护蛋白质活性。
http://C:\Documents and Settings\adim\桌面\001.jpg

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btcputus

第1楼2010/01/27

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洗脱条件温和，充分防止蛋白变性
蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将蛋白A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。
早期的蛋白A柱结合的都是天然蛋白A。天然蛋白A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成，分子量约42KD，结构如图一所示。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然蛋白A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。

为了解决这些问题，科学家们运用基因工程技术，克隆出蛋白A的基因，并对其进行改造，除去了一些不重要的非结合域。偶联这种重组蛋白A的琼脂糖凝胶柱在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。目前，市场上绝大部分重组蛋白A柱都是这种产品。但是，纯化时所用的洗脱液一般为pH=2.7的甘氨酸溶液，如果洗脱效果不是很理想，还要降低pH，采用pH=1.9的甘氨酸溶液。由此可见，此法洗脱条件比较剧烈，最后收集的蛋白质很有可能变性，或者是复性困难。
这种洗脱条件剧烈的柱子结合的重组蛋白A一般具有5个串联结构域：E、D、A、B、C。虽然每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。因此洗脱条件不均一，而且经常需要较低的pH值。GE的重组蛋白A柱即为这种类型，如图二所示。考虑到减少串联结构域的个数，并且采取同型结构域串联，就可以避免不同结构域与抗体Fc 段亲和性的差异从而使洗脱条件温和而均一，Putus研制出了含有三个串联B结合域的重组蛋白A，如图二所示。同时，我们用Putus重组蛋白A柱和GE重组蛋白A柱纯化人血浆，纯化的结果用于比较两种纯化柱的纯化效果，结果如图三所示。
GE
Putus
图二、重组蛋白A结构示意图
待纯化样品：人血浆
实验材料：
GE公司的重组蛋白A柱（E、D、A、B、C结构域串联，见图二）
Putus公司的重组蛋白A柱（3个B结构域串联，见图二）
实验方法：
分别按照每个公司的说明书来操作，洗脱条件分别为pH值3.0和4.5， SDS-PAGE检测结果如下：

上图从左边起，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为经过GE填料洗脱后抗体，泳道3为经过Putus填料洗脱抗体，泳道4为人血浆。从图中，我们可以看出，与GE 重组蛋白A填料从人血浆纯化抗体纯度比较，拥有3个同型结构域的Putus填料可以获得同样纯度的抗体。但是，后者的洗脱条件仅为4.5，高于前者的洗脱条件3.0。由此可见，使用具备较少B结构域的重组蛋白A柱也能获得高纯度的IgG，并且洗脱条件温和，能防止蛋白质聚集，保护蛋白质活性。
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dioclu

第3楼2011/09/19

基因重组蛋白种类有很多,不同基因重组蛋白应用范围也会有细微的差别
基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时,由于表达量高,往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率,是生物工程技术的一个研究热点。