【转帖】兽药企业清洁验证

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取样与检验方法学

最终淋洗水取样

最终淋洗水取样为大面积取样方法，其优点是取样面大，对不便拆卸或不宜经常拆卸的设备也能取样。因此，其适用于擦拭取样不宜接触到的表面，尤其适用于设备表面平坦、管道多且长的液体制剂的生产设备。

取样的方法为：根据淋洗水流经设备的线路，选择淋洗线路相对最下游的一个或几个水口为取样口。分别按照微生物检验样品和化学检验样品的取样规程收集清洁程序最后一步淋洗即将结束时的水样。也可在淋洗完成后在设备中加一定量的工艺用水，用两必须小于最小生产批量，使其在系统内循环后在相应的位置取样。如验证试验中采用最后一方法，其结果的可靠性要好一些，这是可以预见的。

对淋洗水样一般检查残留物浓度和微生物污染水平。如生产有澄明度与不溶性微粒要求的制剂，通常要求淋洗水符合相关剂型不溶性微粒和澄明度的标准。

2 擦拭取样

擦拭取样优点是能对最难清洁部位直接取样，通过考察有代表性的最难清洁部位的残留物水平评价整套生产设备的清洁状况。通过选择适当的擦拭溶剂、擦拭工具和擦拭方法，可将清洗过程中未溶解的，已“干结”在设备表面或溶解度很小的物质擦拭下来，能有效弥补淋洗取样的缺点。检验的结果能直接反应出各取样点的清洁状况，为优化清洁规程提供依据。

擦拭取样的缺点是很多情况下须拆卸设备后方能接触到取样部位。

3擦拭工具和溶剂

进行擦拭取样时应注意擦拭工具和溶剂对检验的干扰。常用的擦拭工具为药签，在一定长度的尼龙或塑料棒的一端缠有不掉纤维的织物。药签应耐一般有机溶剂的溶解。棉签容易脱落纤维，故在使用前应用取样用溶剂预先清洗，以免纤维遗留在取样表面。

溶剂用于擦拭时溶解残留物并将吸附在擦拭工具上的残留物萃取出来以便检测。用于擦拭和萃取的溶剂可以相同也可不同。一般为水、有机溶剂或两者的混合物，也可含有表面活性剂等以帮助残留物质溶解。

选择溶剂的原则：

(1)溶剂不得在设备上遗留有毒物质。

(2)应使擦拭取样有较高的回收率。

(3)不得对随后的检测产生干扰。

药签的选择原则：

(1)能被擦拭溶剂良好地润湿。

(2)有一定的机械强度和韧性，足以对设备表面施加一定的压力和摩擦力，并不脱落纤维。

(3)能同擦拭和萃取溶剂相兼容，不对检测产生干扰。

擦拭取样操作规程

(1)计算所要擦拭表面的面积。每个擦拭部位擦拭的面积应以获取的残留的量在检测方法的线性范围内为原则。通常为25cm²或100cm²。

（2）用适宜的溶剂润湿药签，并将其靠在溶剂瓶上挤压以除去多余的溶剂。

（3）将药签头按在取样表面上，用力使其弯曲，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转药签，让药签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直。

药签擦拭取样示意图

（4）擦拭完毕后，将药签放入试管，并用螺旋盖旋紧密封。

（5）按照下述方法制备对照样品：按步骤（2）润湿药签，将药签直接放入试管并旋紧密封，将该样品与其他样品一起送检验室。

（6）取样后应在试管上注明有关信息。

擦拭取样也用于微生物取样。应使用无菌的擦拭棒，按取表面微生物样的求取样。

检验方法

检验方法应经过验证。检验方法对待检测物质应有足够的专属性和灵敏度。方法验证还包括精密度，线性范围，回收率试验。对用于清洁验证的检验方法的定量要求不必像成品质量检验那样严格。一般要求线性范围应达到残留物限度的50％至150％。代表精密度的RSD小于10%即可。方法的回收率可与取样的回收率结合进行。

取样验证

取样过程需经过验证。通过回收率试验验证取样过程的回收率和重现性。求包括取样回收率和检验方法回收率在内的综合回收率不低于50％，体现重现性的多次取样回收率的RSD不大于20％。

取样过程的验证实际上是对药签、溶剂的选择、取样人员操作、残留物转移到药签、样品溶出(萃取)过程的全面考察。

验证方法：

(1)准备一块500mm×500mm的平整光洁的不锈钢板。

(2)在钢板上用钢锥划出400mm×400mm的区域，每隔100mm划线，形成16块100mm×100mm的方块。

(3)配制含待检测物浓度为0.016％的溶液，定量装入喷雾器。

(4)将约10ml溶液尽量均匀地喷在400×400mm的区域内。

(5)根据实际喷出的溶液体积计算单位面积的物质量(约lµg/cm²)。

(6)自然干燥或用电吹风温和地吹干不锈钢板。

(7)用选定的擦拭溶剂润湿擦拭工具，按前述擦拭取样操作规程擦拭钢板，每擦拭一个方块(100cm²)换一根擦拭棒，共擦6～10个方块。

(8)将擦拭棒分别放入试管中，盖上试管盖，加入预定溶剂10ml，并放置10min，使物质溶出。

(9)用预定的检验方法检验，计算回收率和回收率的RSD。

取样员的取样方式是产生较大RSD的主要原因。应尽可能采用固定的力度

和线路。取样员可根据擦拭棒弯曲的程度估算加在擦拭表面的压力。

4．清洁方法的优化及验证文件

清洁方法的优化

在实际生产中，一台(组)设备用于多种产品的生产是非常普遍的现象。有时各种产品的物理、化学性质有很大差异。这就给清洁规程的制定者提出这样的问题：是否要为每个产品分别制定清洁规程呢?经验告诉我们，为台(组)设备制定多个清洁规程并不可取，这不但由于为每个规程进行验证的工作量过于庞大，更主要的是对操作者来说要在多个规程中选择适当的清洁方法很容易造成差错。比较可行的方法是在所有涉及的产品中，选择最难清洁的产品为参照产品，以所有产品／原料中允许残留量最低的限度为标准(最差条件)，优化设计足以清除该产品／原料以达到残留量限度的清洁程序。验证就以该程序为对象，只要证明其能达到预定的要求，则该程序能适用于所有产品的清洁。当然，从环保和节约费用的角度考虑，如果实践证明该清洁程序对大多数产品而言过于浪费，也可再选择一个典型的产品进行上述规程制定和验证工作。这时，在规程中必须非常明确地规定该方法适用于哪些产品，还须明确为防止选择时发生错误需要采取的必要的措施。

清洁验证试验至少进行三次。每批生产后按清洁规程清洁，按验证方案检查清洁效果、取样并化验。重复上述过程三次。三次试验的结果均应符合预定标准。如果出现个别化验结果超标的情况，必须详细调查原因。如果有证据表明结果超标是因为取样、化验失误等原因造成，可将此数据从统计中删除。否则应判验证失败。不得采用重新取样再化验直至合格(Testinguntilclean)的做法。验证失败意味着清洁规程存在缺陷，应当根据化验结果提供的线索修改清洁规程，随后开展新一轮的验证试验。

在发生下列情形之一时，须进行清洁规程的再验证：

(1)清洁剂改变或清洁程序作重要修改。

<2)增加生产相对更难清洁的产品。

(3)设备有重大变更。

(4)清洁规程有定期再验证的要求。

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由于本步骤的目的是除去已溶解的低浓度的残留物，并使残留在设备上的水具有尽可能高的质量(最小的可溶性固体，最低的微生物污染水平)，在淋洗水的压力、流速、淋洗持续时间及水温等诸影响因素中，水温的重要性相对下降。当然，较高的温度有助于残留水的挥发，并兼有一定的消毒作用。

(5)干燥

根据需要决定是否进行干燥：除去设备表面的残留水分可防止微生物生长，由于水膜有可能掩盖残留物，一定程度上有碍检查。因此对于须暴露保存的设备，应进行干燥。但对于经过验证的清洁程序，如果设备淋洗后要进行灭菌处理，或是采用高温、无菌的注射用水淋洗后并保持密闭的设备则不一定要进行干燥处理。

(6)检查

通常经过验证的清洁程序应保证清洁后的设备不残留可见的残余物。进行目检可在发生意外时，仍能及时发现而采取补救措施，不危及下批产品。因此，在规程中可作出类似规定，如：目检所有设备的表面，不得有残余物。如发现残余物，向工段长汇报以采取纠正措施。

(7)贮存

规定已清洁设备和部件的贮存条件和最长贮存时间，以防止再次污染。

(8)装配

应规定将被拆卸部件重新装配的各步操作，附以图表和示意图以利于操作者理解要注意装配期间避免污染设备和部件。

3 清洁剂的选择

清洁剂应能有效溶解残留物，不腐蚀设备，且本身易被清除。随着环境保护标准的提高，还应要求清洁剂对环境尽量无害或可被无害化处理。根据这些标准，对于水溶性残留物，水是首选的清洁剂。不宜提倡采用一般家用清洁剂，因其成分复杂、生产过程中对微生物污染不加控制、质量波动较大且供应商不公布详细组成。使用这类清洁剂后，还会带来另一个问题，即如何证明清洁剂的残留达到了标准?应尽量选择组成简单、成分确切的清洁剂。根据残留物和设备的性质，企业还可自行配制成分确切的清洁剂，如一定浓度的酸、碱溶液等。企业应有足够灵敏的方法检测清洁剂的残留情况，并有能力回收或对废液进行无害化处理。

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二、清洁验证的合格标准

清洁验证方案必须符合一般验证方案的共性要求。验证方案中最关键的技术问题为如何确定最难清洁物质、最难清洁部位和取样部位、最大允许残留限度和相应的检测方法。

1 最难清洁物质

一般兽药都由活性成分和辅料组成。对于复方制剂，含有多个活性成分。所有这些物质的残留物都是必须除去的。在清洁验证中是否需要为所有残留物都制定限度标准并一一检测呢?这是不切实际且没有必要的。由于相对于辅料而言，活性成分的残留物对下批产品的质量、疗效和安全性有更大的威胁，通常的做法是将残留物中的活性成分确定为最难清洁物质。如果辅料的溶解度非常小，则应根据具体情况决定是否也应将该辅料列为最难清洁物进行考察。如存在两个以上的活性成分时，其中最难溶解的成分即可作为最难清洁物论处。

2 最难清洁部位和取样点

在讨论如何确定最难清洁部位前，首先应当对清洗过程的机理有所了解。

除手工擦洗主要依靠机械摩擦力将附着在设备表面的残留物除去外，常规的清洗主要依靠溶剂对残留物的溶解作用以及流动的清洁剂对残留物的冲击。而溶解的速度取决于单位时间内由溶质表面进人溶液的溶质分子数与从溶液中回到溶质表面的分子数之差。一旦差值为零，表面溶解过程达到动态平衡，此溶液即为饱和溶液，溶解过程中溶质很快形成一薄层饱和溶液，饱和溶液中的溶质分子不断向溶液深处扩散，形成从溶质表面到溶液深处的一个递减的浓度梯度。如果处于饱和层的溶质分子不能迅速进人溶液深处，就会降低溶解的速度。因此可以观察到即使是溶解度很大的物质，静止状态下的溶解过程是非常缓慢的。提高

溶解速度的方法是使溶液流动以迫使溶质表面的饱和层离开。

在清洗过程中，必须使清洁剂在运动中与残留物接触。清洁剂与残留物的相对运动从宏观上可分解为垂直方向和水平方向的运动。相对垂直的运动可将已溶解的物质迅速带离溶质表面，而水平方向的相对运动根据流体力学的基本原理，可分为层流和湍流两类情况。

层流指流体在导管中流动时，所有质点均沿着与管轴平行的方向流动。此时流体在管道轴心处的速度最大，自轴心至管壁速度逐渐减小以至等于零。由此可以推断，如果清洁剂在待清洗设备中形成了层流，会很迅速地在残留物表面形成—稳定的饱和溶液层，残留物的溶解速度会急剧下降，这与静止状态下的溶解过程非常相似，从而清洁效率也随之明显下降。因此在清洁中应避免层流的产生。

流体以湍流形式流动时，虽然宏观上流体沿管道向一个方向流动，但从微观上看各质点的运动速度在大小和方向上都随时发生变化。总有部分质点的运动方向相对垂直于管轴或管壁。这样残留物表面再也不会形成稳定的饱和层，溶解的速度大大提高了，清洁的效率也随之提高。因此，在清洗过程中，必须保证清洁液以湍流形式流动。

综合而言，凡是死角、清洁剂不易接触的部位如带密封垫圈的管道连接处，压力、流速迅速变化的部位如有歧管或岔管处、管径由小变大处，容易吸附残留物的部位如内表面不光滑处等，这些部位都应视为最难清洁的部位。

显然，取样点应包括各类最难清洁部位。

3 残留量限度的确定

如何确定残留量限度是个相当复杂的问题，但却是验证方案必须解决的问题；，FDA在其《清洁规程验证检查指南》中指出：“FDA不打算为清洁验证设立一个通用方法或限度标准。那是不切实际的，因为原料和制剂生产企业使用的设备和生产的产品千差万别，确立残留物限度不仅必须对所有有关物质有足够的了解，而且所定的限度必须是现实的、能达到和可被验证的。”也就是说，鉴于生产设备和产品性质的多样性，由兽药监督机构设立统一的限度标准和检验方法是不现实的。企业应当根据其生产设备和产品的实际情况，制定科学合理的，能实现并能通过适当的方法检验的限度标准。

目前企业界普遍接受的限度标准基于以下原则：

●分析方法客观能达到的能力，如浓度限度为1／100000

● 生物活性的限度，如正常治疗剂量的1／1000；

● 以目检为依据的限度，如不得有可见的残留物。

最后一项系定性标准，是定量标准的补充。

残留物浓度限度10mg／kg：

将残留物浓度限度定为10mg／kg为发达国家生产液体制剂如溶液、乳剂等剂型的企业采用。其要求是规定由上一批产品残留在设备中的物质全部溶解到下一批产品中所致的浓度不得高于10mg／kg（0.001%）。对液体制剂而言，这就是进入下批各瓶产品的残留物浓度。一般地，除非是高活性、高敏感性的兽药，该限度的安全性是足够的。企业可进一步将其简化成最终淋洗水样品中的有关物质的浓度限度为100mg／kg。 。

验证时一般采用收集清洁程序最后一步淋洗结束时的水样，或淋洗完成后在设备中加入一定量的水(小于最小生产批次量)，使其在系统内循环后取样，测定相关物质的浓度。实验室通常配备的仪器如HPLC，紫外—可见分光光度计、薄层色谱等的灵敏度一般都能达到10mg／kg以上，因此该限度标准不难被检验。