【讨论】DNA胶回收中常见问题分析

省部重点实验室

2010/11/18

私聊

生命科学仪器综合讨论

DNA胶回收中常见问题分析

1、如何计算提取率？

1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率；

2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比；

3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。

2、如何简易测算提取率？

取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5—10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。

3、如何看待提取得率？

影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。

4、回收率为什么与点样量和片段大小有关？

DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。

5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？

1）胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；

2）胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收；

3）紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内；

4）洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；

5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好。

6）回收前的样品量太少，加大点样量

7）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。

6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？

1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；

2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；

3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。

7、琼脂糖凝胶块不溶？

1）琼脂糖质量不好;

2）含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃；

3）制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。

8、点样时发现DNA样品有漂出点样孔外的现象？

柱子上的乙醇未完全挥发干净，延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。

9、能否使用去离子水洗脱回收？

可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值＞7.0，以增加回收得率。

10、能否使用TE（PH8.0）洗脱？

可以

11、可否使用小于30μl的洗脱液进行洗脱？

不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。

12、关于DNA片段大小与回收率的问题？

100bp-500bp，30-60%；500bp-4kb，80-95%；4kb以上，30-50%。

13、OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符？

从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A₂₆₀的值

14、吸光度纯度测定时应注意的问题

吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。

15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？

在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。

分
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