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【资料】液相色谱串联质谱法测定饲料中8种苯并咪唑类药物

雾非雾

2010/11/27

私聊

兽药/抗生素检测

液相色谱串联质谱法测定饲料中8种苯并咪唑类药物

摘要建立了同时测定饲料中8种苯并咪唑类药物（噻苯咪唑、丙硫咪唑、硫苯咪唑、苯硫氧咪唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和三氯苯唑）的液相色谱串联质谱分析方法。饲料样品直接用酸化乙腈提取，提取液用甲酸溶液稀释后直接进行分析。分析时采用XBridgeTM C18色谱柱，以甲酸溶液-乙腈体系进行梯度洗脱，MRM方式测定，基质外标法定量。苯并咪唑类药物在0.02~10 mg L-1浓度范围内呈良好的线性，线性相关系数均大于0.990，苯并咪唑类药物在饲料样品中最低检测限为2.1~63.0μg/kg。饲料中苯并咪唑类药物在0.50~200 mg/L范围内的回收率为84.0%~104%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10%。

关键词苯并咪唑类药物；液相色谱串联质谱法；饲料

苯并咪唑类药物（benzimidazoles, BMZs）属于广谱、高效、低毒抗蠕虫药，由于对胃肠线虫具有很强的驱杀作用，至今仍在广泛使用。但由于BMZs在实验动物和靶动物显示致畸和致突变作用，目前使用的BMZs多数是食品残留中重要的监控对象，且BMZs在体内转化的代谢产物仍具有毒理作用^[1-2]，所以我国以及联合国粮农组织、欧盟、美国、日本等国家和组织都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物，并制订出各种苯并咪唑类药物在不同动物体内（肌肉、组织、奶等）的最高残留限量。饲料安全直接关系到动物性食品的安全，考虑到苯并咪唑类药物经常被添加到饲料中使用，故很有必要进行饲料中苯并咪唑类药物的分析研究。

目前对于动物组织中苯并咪唑类药物的分析方法较多，而饲料中苯并咪唑类药物分析方法国内未见发表，国外也较少^[3-6]，涉及的种类也较少，最多的仅有5种药物^[6]。动物组织和饲料中BMZs分析涉及的主要分析手段有：酶联免疫吸附法( ELISA) ^[7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)^[8]、高效液相色谱法(HPLC)^{[3-5, 9-10]}及高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）^[11-15]，高效毛细管电泳法（HPCE）^[6]。考虑到苯并咪唑类药物在我国使用情况，本研究选择了8种常用苯并咪唑类药物，考虑到LC-MS/MS法灵敏度高的特点，样品酸化乙腈提取后直接稀释后进行液相色谱串联质谱分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters 2695 Quattro Micro^TM API高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司），配置电喷雾离子源；固相萃取仪（美国Supelco 公司）；Sigma离心机。噻苯咪唑和丙硫咪唑标准品（Accustandard 公司）；硫苯咪唑、苯硫氧咪唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和三氯苯唑标准品（Dr. Ehrenstorfer）。乙腈、二甲亚砜和甲酸为色谱纯（Fisher公司）。

1.2 仪器条件

XBridge^TM C₁₈色谱柱(150 mm×2.1 mm，内径3.5 μm)；流动相A为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈，梯度洗脱条件：B相在1.0 min内从15%线性增加到25%，再在2.5 min内线性增加到95%，保持3.5 min，然后在0.1 min内降至15%，保持4.9 min；流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL；柱温：30℃。

质谱条件：ESI源正离子模式电离；多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 KV；萃取锥孔电压：20 V；RF透镜电压：0.5 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气流速：600 L/h；倍增器电压：650 V；二级碰撞气：氩气；其它条件详见表1。

1.3 样品处理

称取2g试样（精确到0.01g）于50 mL离心管中，加入20 mL0.5 %甲酸乙腈，涡旋1 min，然后超声提取10 min，以5000 r/min的速度离心5 min后吸取1.0 mL上清液于5 mL刻度试管中，加入3 mL0.1 %甲酸溶液于试管中，混匀后过0.22 μm滤膜，进行液相色谱串联质谱分析。

1.4 线性实验

准确称取各10.0 mg BMZs标准品于相应的10mL容量瓶中，噻苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和丙硫咪唑用二甲亚砜溶解并定容至刻度，其余4种BMZs用甲醇：二甲亚砜（2：3 v/v）溶解并定容至刻度，即得均为1000 mg/L标准储备液。分别吸取1.0 mL各标准储备液于同一10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得100 mg/L的混合标准工作液。分别准确移取苯并咪唑类药物混合标准中间液适量，配制浓度为0.2.、0.8、2.0、10.0、40.0和100.0 mg/L的系列标准溶液，吸取0.1 mL于5 mL刻度试管中，再吸取空白试料提取液0.9 mL于该5 mL刻度试管中，加入3 mL0.1%甲酸溶液后混匀过膜，进行上机测定，以定量离子对峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制基质校准标准曲线。

2 结果与分析

2.1 液相色谱质谱分析

苯并咪唑类药物色谱分析时，通常采用反相分离体系，主要有三类流动相体系：离子增强体系，pH2~3，一般使用乙腈-磷酸或磷酸盐体系；离子抑制流动相体系，pH5~7；离子对流动相体系，离子增强流动相中加入阴离子对试剂。对于多组分苯并咪唑类药物液相色谱质谱分析时，通常采用离子增强体系进行梯度洗脱，如0.1%甲酸溶液-乙腈体系，因为该体系和纯水-乙腈体系相比色谱峰的拖尾现象得到了明显改善。

苯并咪唑类药物属弱碱性物质，中等极性，在酸性条件下很容易质子化，于是本方法选择ESI+进行分析。以乙腈/0.1%甲酸溶液(3:7，v/v)为溶解液，用蠕动泵（20μL/min）对苯并咪唑类药物的质谱条件进行优化。经过优化的条件为：毛细管电压：3.0KV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流速：50L/h；脱溶剂气流速：600L/h。其它条件详见表1。

2.2 提取净化方法的选择和优化

目前，对于饲料和组织样品中苯并咪唑类药物的提取方法主要有两类：一类是用乙腈、甲醇或其酸化溶剂进行提取，主要是因为它们具有良好的脱蛋白、释放药物和溶解药物的能力；另一类主要是将样品pH值调至近中性或与高浓度的弱碱性溶液匀浆，藉离子抑制和盐析作用促进乙酸乙酯、氯仿等溶剂萃取。本实验考虑到液相色谱串联质谱法分析苯并咪唑类药物时灵敏度较高和饲料中苯并咪唑类药物浓度较高时才会有药效(通常浓度为30~100mg/kg)，拟采用极性溶剂提取后稀释直接进样分析。并对乙腈和0.5%酸化乙腈的提取效果进行了比较，当采用乙腈时回收率（添加浓度30mg/kg）在75.1%~84.7%之间，0.5%酸化乙腈提取回收率在90.9%~99.2%之间。

2.3 基质效应

空白样品提取后，用含有8种苯并咪唑类药物的标准溶液制备基质校准标准溶液，与标准溶液进行比较确定基质效应，浓度为1.0mg/L（猪配合饲料），结果详见表2。从表中可知噻苯咪唑和硫苯咪唑有约40%的基质抑制，其余6种药物无明显基质效应，噻苯咪唑和硫苯咪唑基质效应较强可能是因为它们出峰时间处有较多干扰组分的存在。

2.4 线性实验

根据1.4进行线性实验，绘制标准曲线，所得曲线方程为y＝19.698x-83.833（噻苯咪唑）、y＝57.116x+254.78（苯硫氧咪唑）、y＝211.20x+1381.7（氟苯咪唑）、y＝214.21x-754.72（硫苯咪唑）、y＝229.98x-1362.2（甲苯咪唑）、y＝416.73x+2229.7（丙硫咪唑）、y＝305.27x-955（丙氧苯唑）和y＝40.253x+173.28（三氯苯唑），相关系数（r²）均大于0.990，说明本方法适用于苯并咪唑类药物的定量分析。

2.5 方法的检出限、回收率和精密度

采用在空白样品中添加标准溶液的方法（其中0.5 mg/kg和30 mg/kg添加浓度用100 mg/L的混合标准工作液添加；200 mg/kg添加浓度用各药物1000 mg/L的标准储备液添加，并用氮气缓慢吹干后进行提取操作），对8种苯并咪唑类药物在猪配合饲料样品中进行了3次添加回收率实验，每个浓度点进行5次重复，实验结果见表3。从表3可见，猪配合饲料中苯并咪唑类药物的回收率分别为84.0%~104%。批内RSD分别为2.5%~5.2%，批间RSD分别为3.6%~7.5%，在可见该方法具有较好的准确性和重现性。同时按信噪比S/N=3：1计算该方法对苯并咪唑类药物的检测限为2.1 ~63.0μg/kg。

2.6 实际样品测定

利用该方法对12个猪配合饲料中8种苯并咪唑类药物进行测定，未发现添加有苯并咪唑类药物的饲料样品。

3 结论

本文建立了饲料中8种苯并咪唑类药物的液相色谱串联质谱分析，方法非常简单，仅使用酸化乙腈提取一次，然后经稀释即可进样分析。猪配合饲料中8种药物的添加回收率在84.0%~104%之间，批内RSD在2.5%~5.2%之间，批间RSD在3.6%~7.5%，检测限为2.1~63.0μg/kg。整个方法具有准确和灵敏的特点，能满足饲料中苯并咪唑类药物同时定量分析需要。
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