兰州大学 王映珍
第四章 RT-PCR应用
机枪射手
第1楼2011/01/14
图17 室温条件下DNA聚合酶活性的完全抑制
对Taq DNA聚合酶和Platinum® Taq DNA聚合酶的活性分析在37℃进行5个小时。
一步得到高灵敏度
Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质。仅需在反应混合物中加入总RNA或poly(A)+,基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针,然后就可以开始实验了。您可以精确定量到最低10个目的RNA分子或从1pg总RNA(图18)。除了高特异性外,一步法步骤减少了反应变量,降低了污染可能性,适合高通量应用。
图18 一步法RT-PCR
β-actin mRNA的定量。使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统扩增六份不同量的Hela总RNA,然后在ABI PRISM® 7700上,使用6-FAM标记的TaqMan®探针检测。使用了TAMRA做为报告信号(Rn)均一化的被动参考。
超越竞争对手
总而言之,领先的逆转录和PCR技术同一步法整合在一起会尽您所需,产量、特异性和灵敏度,得到高水平的qRT-PCR。图19将使用Platinum®Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较。Platinum®系统表现出更低的Ct(阈循环)和更高的产量,使其对于检测低拷贝的mRNA转录本更敏感。
图19 使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统获得高产量
使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统(蓝点)或竞争对手P的QuantitativeOne-Step RT-PCR系统(红点),按生产厂商的建议,对145bp的β-actin片段进行qRT-PCR分析。起始RNA从5μg到50fg按10倍递增变化。使用TAMRA做为被动参考收集均一化的相对荧光(Rn)。图版A:线性量扩增图。图版B:标准曲线图。获得一步法的成功