【分享】梯度洗脱 注意事项

3、试剂的纯度 梯度洗脱要想保证好的重现性，溶剂的纯度要求更高，脱气在这里也成为了必须保质保量完成的任务，因为有些溶剂互溶的时候，脱气不好会产生气泡。

4、试剂的黏度 做梯度洗脱的同志，会发现压力波动范围变大，不要大惊小怪，由于溶剂黏度不同，当变化较快的时候，肯定会出现压力波动现象。比如用醋酸溶液和乙腈作为流动相，由于乙腈的黏度小于醋酸溶液，因此当乙腈比例提高时，压力会下降。还有个例子，纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。当然，不要让柱压超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

5、色谱柱再生 再生这个词用在这里似乎有些不妥，准确的说法是使色谱柱恢复到初始的状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！ 好了，就说这些吧！

楼主....说脏话

学习，嘿嘿，努力

其实他们不是懂不懂得问题,而是对事物的认识永远处在幼稚的状态,没办法..他们要想进步,除非他们要真正的用心

哈哈，楼主的话很经典，很实在，特别是对鬼峰的概念。

等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变（例如50%甲醇-水），而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的（例如5→100%甲醇-水）。梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。

许多样品用梯度洗脱会分离更好，但许多实验室却对梯度洗脱的应用存在很大偏见。其原因有如下几点：

1、有些实验室尚不具备梯度洗脱设备。

2、梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析。

3、某些HPLC检测器（如示差折光检测器）不能使用梯度洗脱。

4、每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。

5、不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异。

6、梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂。

7、某些色谱柱╱流动相的联合应用不适于梯度洗脱。

如权衡采用梯度洗脱对每一分离的优缺点，那么很多分离将只适于使用梯度洗脱。

梯度洗脱的应用

1、具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5）。

2、大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品）。

3、样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。

4、溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。

此外，即使最终有可能使用等度方法，初始实验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点。