【分享】紫外吸收法测蛋白质含量

2.280nm和260nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：

纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 » 1.8

纯核酸的光吸收比值： A280/A260 » 0.5

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质(酵母烯醇化酶)和核酸(酵母核酸)的混合液所测定的数据来建立的。

3.215nm与225nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差： 吸收差D= A215 －A225

以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、(NH₄)2SO₄以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。

4.肽键测定法

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。

本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

相当不错的资料分享

应助达人

实际上，用于测蛋白，还是不准确，是吧？

这个方法没有凯氏法准确吧

没有用这个方法做过，学习了

应助达人

没有，要不早就取代了，且分光光度计每个实验室都有，就不能再配置蛋白测定仪了。

应助达人

具有紫外吸收的氨基酸才能用紫外分光光度计测定。

方法不错就是没有凯氏定氮法简便！

不错的资料，谢谢楼主