【分享】真菌检验技术的进步

　二、自临床标本中直接检查抗原

　　深部真菌感染者血中难于培养出菌体，尤其是丝状真菌菌体常粘附、缠绕于组织，血中不易出现。但组织中菌体可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染组织液中直接检查真菌抗原为快速诊断的重要手段；虽也可检查抗体，但难达快速诊断。

　　（一）、检测念球菌属的甘露聚糖及其抗原

　　1.胶乳凝集试验

　　取300μl血清，加100μlEDTA处理液，混匀，煮沸3min，离心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi胶乳粒子，3min内出现凝集为阳性。

　　2.EIA法。以单抗包被酶标板，用双抗体夹心法检查血清中念球菌抗原。

　　3.检测血中的白色念球菌的甘露聚糖抗体。ENA法检查中甘露聚糖对念珠菌感染的诊断敏感性40%，特异性98%，ENA法检查甘露聚糖抗体对念珠菌感染的诊断敏感性53%，特异性94%.

　　4.检查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇与L-阿拉伯醇的比值可快速诊断念珠菌病。Yeo等用基因重组的D-阿拉伯醇脱氢酶以酶荧光法定量，发现念珠菌感染者血清中来自菌体的D-阿拉伯醇明显升高，用此法迅速论断新生儿的侵袭性念珠菌病。

　　Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其烯醇化酶（Enlase）抗原的阳性率71.8%，特异性100%；应用胶乳凝集检查热敏性糖蛋白抗原阳性率76.9%，特异性87.5%；应用胶乳凝集检查甘聚糖抗原阳性率75.6%，特异性100%，应用鲎试试验检查细胞壁组分β-Glucan的阳性率84.4%，特异性87.5%.

（二）、肺曲菌病的血清抗原检查

　　1.胶乳凝集试验检查血清中半乳甘露聚糖。方法如上述胶乳凝集试验。

　　2.单抗ELISA法检查血清中半乳甘露聚糖抗原，敏感性达1.0ng/ml.

　　3.DELFIA法。Eu标记的时间分辨荧光分析法敏感性达0.5ng/ml.

　　（三）、血清中查组织胞浆菌抗原

　　以此菌荚膜的69-70kd抗原制出单抗以ELISA法检出可及时明确诊断。

　　（四）、尿中检查马尼菲青霉菌抗原

　　以该菌外壁的膜蛋白为抗原制出单抗，以ENA法诊断33例患者，52例健康人和248例无真菌感染的住院患者均为阴性。本法的特异性98%，敏感性97%，阳性予示值84%，阴性予示值99.7%.

　　（五）、新形隐球菌的抗原检查

　　新形隐球菌具有荚膜多糖抗原，可以单抗致敏的胶乳凝集试验快速检出。其荚膜多糖的主要成分为Glucuronoxylomannan，以此抗原的单抗包被酶标板，以双抗体夹心法检出抗原，血清稀释1：8为阳性。Feldmesset用此法自AIDS患者引发新形隐球菌性脑膜炎的血清中检出抗原而及时诊断。

　　（六）、深部丝状真菌感染的抗原检查。

　　丝状真菌的细胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鲎试剂（鲎凝固酶）检出。以20μg/ml为界限值。文献报告检查41例深部丝状真菌感染者，37例阳性，敏感率90%，特异性100%.

三、检查真菌的特异性酶

　　白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶，如用适当底物检测，此两酶同时阳性，即可确定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶。克柔念珠菌具酸性磷酸酶，热带念珠菌具吡咯磷酸酶，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隐球菌具酚氧酶，均可用适当呈色底物快速完成鉴定。

　　四、分子生物学技术

　　（一）、用PCR等技术字标本中扩增真菌DNA.国内应用PCR与反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌主要种别。国外可以用PCR-DEIA技术从血清中扩增出白色念珠菌的DNA来诊断念珠菌病。

　　针对真菌的共同序列而设计的‘全能引物’而扩增580bp的产物，为真菌所共有。检测血液标本即可明确体内有无真菌感染。

　　（二）、用于真菌的型别分析。国内应用随机引物PCR扩增后进行真菌分型，结果可靠。应用随机引物扩增物多态性分析（RAPD）可以将5种曲霉菌鉴别开（烟、黄、黑、土、构巢曲霉）。国外结合PCR与酶标记探针在纸条上进行检测可鉴别出主要的致病性真菌。

　　（三）、检出念珠菌的基因变异快速确定念珠菌对酮康唑的耐药性。此种耐药性由基因的1554T突变为C而致，应用Lightcycler仪器，以荧光共振能量转移和基因片段溶解温度曲线技术测定。