化学分析样品制备（续之前的86讲）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（62）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

免疫亲和或免疫吸着剂（4）

免疫SPE萃取条件的优化

一旦选定了免疫SPE萃取柱，就要优化萃取过程的冲洗和洗脱条件，如果是用离线操作，解析洗脱要使用尽可能少的溶剂，这样就可能需要进一步进行浓缩，为了提高回收率还是需要进行预浓缩的，一般要浓缩到 1mL。

免疫SPE萃取柱要进行冲洗，一般使用近于中性的磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行冲洗，有些文献也用水进行冲洗。进样的酸度也要近于中性，典型的pH 5–8。最适宜的冲洗溶剂为pH 7 的磷酸盐缓冲溶液。如果是克伦特罗，吗啡，异丙隆或绿麦隆可以使用20 ml of PBS或水来冲洗。在所有的分析案例中都使用类似的溶剂，低pH 和几乎相同浓度的PBS乙醇或甲醇溶液进行洗脱。这一通用性操作条件如下图91，它可以减少方法开发的时间



图 91 典型的免疫SPE萃取方案

这一操作系统假设被分析物在加样和冲洗过程中是不可逆结合到免疫SPE萃取柱上的。在洗脱过程是使用完全不同的溶剂，但是要使用温和的条件以便使萃取柱再生进行下一次分析。

类似于上述处理的方法用于水中微量三嗪类农药的萃取，他们使用70%的甲醇进行洗脱，以及河水中、淤泥和组织中多环芳烃的分析。

参考文献：

D. Stevenson, J． Chromatogr. B, 2000,745:39–48

（RNF）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（63）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

免疫亲和或免疫吸着剂（5）

免疫SPE的应用（1）

利用免疫SPE预处理水样选择性萃取苯基脲和三嗪类除草剂，用异丙隆和阿特拉津制备和提纯多克隆抗体，在使兔进行棉衣之前用电喷雾质谱表征免疫偶联。以硅胶为基质的免疫吸着剂，硅胶的共价键耦联抗体的作用要优于刚性亲水性聚合物，因为被分析物和硅胶载体之间没有特殊的相互作用。

使用免疫SPE进行脱机富集表现出免疫吸着剂能够捕集多种这一类除草剂（在13个苯基脲除草剂中有9个可以被富集；9个三嗪类除草剂中有6个可以被富集）。增加甲醇量分步洗脱，被分析物在免疫SPE上具有不同的效用。

这两种免疫SPE的洗脱条件类似，使用70% 甲醇可以很好地洗脱这些除草剂。往塞纳河水中加入苯基脲除草剂和三嗪类除草剂标样，用上述方法分析这种加标样品，显示出极好的选择性，在色谱中没有检测到干扰分析的成分，基线稳定，相当于饮用水样的基线。在地表水样品中0.1 pg/L的异丙隆很容易被检测出来，这一结果表明免疫SPE可以在多残留分析中能够选择性地富集除草剂，对未知样品的分析也证明免疫SPE具有选择性的预浓缩功能。苯基脲除草剂和三嗪类除草剂和它们的半抗原结构如下图。





图 92 三嗪类（a）和苯基脲(c)除草剂,以及它们相应的三嗪类半抗原（b）和苯基脲半抗原(d)结构式

表 92 HPLC级纯水中加入苯基脲类除草剂萃取的回收率




50，200，和500mL HPLC 级水样加入100ng 苯基脲类除草剂,用1g 键合硅胶免疫SPE进行萃取得到的结果（n=3,RSD=5～8%）

参考文献：

Preparation and Evaluation of lmmunosorbents for Selective Trace Enrichment of Phenylurea and Triazine Herbicides in Environmental Waters

V. Pichon,et al., Anal. Chem.,1995, 67: ,2451～2460

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（64）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

免疫亲和或免疫吸着剂（6）

免疫SPE的应用（2）

分析测定水中的微量18-甲炔诺酮

用自己制备的免疫色谱柱（IAC）进行微量避孕药左旋18-甲炔诺酮的萃取和富集，用于水样中18-甲炔诺酮(LNG)的测定，IAC 柱是把特定的抗LNG多可隆抗体以共价键偶联到经CNBr-活化的琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上，制备成SPE小柱。

萃取条件包括加样、冲洗、洗脱溶液以及影响萃取的最佳流速进行优化，纯水、5%和50%的甲醇用作加样、冲洗、洗脱溶液，用于加样、冲洗、洗脱的流速分别为1.0, 2.0 和 0.5mL/min，在优化的条件下，对最大容量、萃取回收率和稳定性进行表征。

实验研究发现用0.2 g 固载化抗体的填料对LNG的最大容量为260 ng，免疫SPE柱的萃取回收率，以三个不同浓度添加量进行估计在95.3–106.9%之间。在使用35次以上后未见损失专属性识别。

使用高效液相色谱（HPLC）为分析手段，在河水和废水样品中可以检测到ng/L 的LNG。



图 93-2 用IAC 萃取柱富集60倍后测定河水中LNG的HPLC色谱图

LNG 的浓度为0.0075ng/mL×600 = 4.5 ng/mL

文献：

Yuwei Qiaoa, Hong Yangb, BinWanga, Juan Songa, Anping Denga，“Preparation and characterization of an immunoaffinity chromatography column for the selective extraction of trace contraceptive drug levonorgestrel from water samples”

Talanta，2009，80：98–103

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（65）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物SPE

分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer， MIP）是一种具有特殊功能的高聚物，它兼备了生物识别体系和化学识别体系的优点, 具有抗恶劣环境、选择性高、稳定性好、机械强度高、制备简单等特点, 可选择性识别富集复杂样品中的目标物. 因此, MIP 被广泛应用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等样品前处理技术。MIP的制备一般要经过三个步骤：

（1）使模板分子和单体分子间产生互补的相互作用，形成复合物；

（2）加入交联剂，在模板-单体复合物周围进行本体聚合反应；

（3）除去聚合物中的模板分子。

由于在聚合过程中模板分子的加入，当洗去聚合物中的模板分子后，在模板聚合物中就会留下一些空穴，其大小，形状及官能团的分布与模板分子具有互补性，因而对模板分子具有选择性。在聚合物上留下模板分子的印迹，因此把它称为分子印迹聚合物。如图 94-1的示意图。



图 94-1 分子印迹聚合制备过程

具体的分子印迹聚合物制备实际例子，由功能性单体（如甲基丙烯酸和乙烯基吡啶）和分子印迹单体（如氨基酸）在一起聚合而成的聚合物，如下图。



分子印迹聚合物SPE近年有大量研究工作，国内也有很多化学家进行了多方面的研究，有关MIP型SPE的综述报告也很多，国内最新的是李攻科教授等在中国科学 B辑上发表的总数论文，国外发表的比较新的是刘锋教授等在J. Biochem. Biophys. Methods上发表的有关MIP用于真实样品处理的综述报告。早一些时间2005年有牟世芬教授的有关MIP作SPE的综述报告，2006年有E. Caro,等的MIP在环境样品中的应用综述。

文献来源：

1．L. I. Andersson, J. Chromatogr. B, 2000,745:3–13

2. 黄健祥, 胡玉斐, 潘加亮, 许志刚, 李攻科, 中国科学 B辑:化学,2009 , 39 (8):: 733 ~ 746

3．Chiyang He, Yuanyuan Long , Junlan Pan , Kean Li, Feng Liu，J. Biochem. Biophys. Methods 2007，70：133–150

4．蔡亚岐, 牟世芬，分析测试学报，2005，24（5）：116～121

5．E. Caro, R.M. Marce ´ , F. Borrull, P.A.G. Cormack, D.C. Sherrington，TrAC,2006,25(2):143～154

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（65）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物 SPE

MIPs 的合成方法

MIPs的合成一般需 3个步骤:

(一) 模板分子和功能单体相互作用形成单体 -印迹分子复合物;

(二)使用大量的交联剂并在致孔剂存在下共聚 , 生成高聚物 , 从而使功能单体上的功能基在特定的空间取向上固定下来;

(三) 通过物理或化学方法除去模板分子得到分子印迹聚合物。这样就在聚合物中留下了一个模板分子一样的三维空间 , 使MIPs对模板分子或类似物具。

有三种合成方法具体来合成MIPs：

1 非共价键合成或是自组装方法，这一方法比较简单，使用者较多，只要把模板化合物和具有适当功能团的一种或几种功能单体，致孔剂/致孔剂加溶剂、 交联剂和引发剂按照一定比例混合 , 模板分子通过静电作用、疏水性作用、π-π作用和氢键等非共价作用力与功能单体和交联剂等生成分子自组装体 , 再在合适的引发条件下反应生成聚合物 , 研磨聚合物为粉末 , 用适当溶剂萃取除去模板分子。该方法也存在一定的缺点 , 例如由于在聚合前,模板分子与功能单体及交联剂可形成不止一种分子络合物 ,故该方法制备的分子印迹聚合物的结合位点就存在一定程度的不均一性。由于非共价的分子间作用力较弱 , 在聚合反应时常常需要加入过量的功能单体,在萃取以后把模板化合物从聚合物中用溶剂洗去，就制备成适合该模板或类似物有专属的识别性的作用了。

2．共价键合成方法,也称为预组装合成法，在合成前首先让模板分子与功能单体发生反应生成模板复合功能单体 , 再在合适的条件下反应生成聚合物 , 研磨聚合物为粉末 , 用适当溶剂除去模板分子 , 这样就制得所需要的分子印迹聚合物。由于该制备方法中模板分子与功能单体之间是靠结合力强的共价键结合的 , 其形成的复合物具有化学性质和立体结构稳定的优点 , 其萃取的特异性要高于其他制备方法。但也有突出的缺点，其一该方法要进行繁琐的模板复合功能单体的制备，而对众多的模板分子并不是总能找到合适的方法来制得该模板复合功能单体。该方法中模板分子与其印迹聚合物之间的结合力强 , 因此其模板流失问题更难解决。另外这种分子印迹聚合物萃取时达到平衡较为困难。因此目前其在固相萃取中很少使用。

3．半共价键法，首先把分子与单体以共价键结合，加入交联剂和引发剂进行聚合反应 , 然后破坏共价键洗脱模板分子，而在使用该分子印迹聚合物对待测物进行萃取时，分子印迹聚合物与待测物之间则仅仅依靠非共价相互作用结合。该法的优点是，由于在聚合物生成时模板分子与单体共价键结合 , 因此该法生成的聚合物结构更加完整，结合位点的均一性好，所以半共价法制备的分子印迹聚合物对模板分子的亲合萃取能力更强 , 萃取容量更大; 同时这种方法制备的聚合物在破坏共价键洗脱模板分子时 , 即使有少量的模板残留在聚合物中，由于其与聚合物之间的结合是很强的共价键，在后面用该聚合物萃取待测物时。一般有机溶剂极难将残留的模板分子洗下来。

文献：

1．蔡亚岐, 牟世芬，分析测试学报，2005，24（5）：116～121

2．E. Caro, R.M. Marce ´ , F. Borrull, P.A.G. Cormack, D.C. Sherrington，TrAC,2006,25(2):143～154

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（66）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物SPE

MIPs 的合成方法

“模板渗漏”和替代模板聚合法

用溶剂处理聚合反应生成的聚合物颗粒时，很难将聚合物颗粒中的模板分子完全清洗干净 , 当用该分子模板聚合物萃取pg～ng/mL范围的样品时，必然会造成严重误差，这种现象就是所谓“模板渗漏”。解决这一问题的有效方法是采用替代模板聚合法，其原理是利用分子印迹聚合物对其模板分子识别时的“交叉反应性”,用分析物的类似物代替分析物作为模板来制备分子印迹聚合物 , 由于“交叉反应性” 的存在，该分子印迹聚合物也对分析物具有萃取能力，即使在萃取过程中发生“模板渗漏”问题 , 由于渗漏出的物质是分析物的类似物，只要能用色谱法将分析物和它的类似物分开，就可避免“模板渗漏” 产生的干扰。

举例：

Andersson等[2]在使用气相色谱测定人血浆样品中的镇痛药物沙美利定前，使用以药物沙美利定为模板合成的分子印迹聚合物进行固相萃取 , 他们发现当样品中分析物浓度极低时(nmol),“模板渗漏”会严重干扰药物沙美利定的测定，作为对该方法的改进,他们在合成分子印迹聚合物时用药物沙美利定的结构类似物代替沙美利定 , 再用这样合成的分子印迹聚合物来进行血浆样品的前处理 , 可满意解决 “模板渗漏”。 沙美利定及其所用的模板化合物结构如图 96-1。图 96-2是用MIP进行固相萃取和L-L萃取后得到GC色谱的比较。




文献

[1] 蔡亚岐, 牟世芬，分析测试学报，2005，24（5）：116～121

[2] L.I.Andersson，A.Paprica， T.Arvidsson，Chromatographia,1997,46(3-4):57～62

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（67）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物SPE

MIP 聚合物制备举例[1]：

如上一讲的在分析人血浆中的镇痛药物沙美利定前，使用类似与沙美利定的化合物为模板，合成分子印迹聚合物，使用合成的MIP进行固相萃取，使用下面结构的化合物进行合成。



称量引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)（ 64 mg, 0.40 mmol)，和化合物3（190 mg, 0.60 mmol)到试管中用4.68g 甲苯溶解，加入甲基丙烯酸（MAA，306 μL，3.6 mmol)和二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDM， 3.56g, 18 mmol)，在冰浴上冷却此请澈的溶液，并用氮气吹扫这一溶液5 min，把试管于室温下用紫外灯(366 nm)照射24小时，把试管粉碎后用甲醇浸泡聚合物除去模板化合物和未反应的单体，在研钵里加水磨碎聚合物，用25μm 的筛子带水筛分磨碎的颗粒，收集通过筛子的颗粒物，没有通过筛子的颗粒继续研磨，用连续在甲醇中沉降的方法除去其中的粉尘，在一个分液漏斗中分离和洗涤沉淀物，洗涤溶液为500mL 1 M NH₄Ac溶于40 % 2-丙醇、25% 乙酸、和35% 水中的混合物，之后用300 mL 25 %乙酸的乙醇溶液、300 mL 1 M NaOH 在20 % 的乙醇中的溶液、以及300 mL 甲醇进行洗涤，最后在真空下干燥这一颗粒物，在室温下储存备用。

用MIP处理样品

约 600mg 解冻的人血清样品，内标物（2.60μL最后的浓缩物50.17 nmol)和10 % Na₂CO₃(300 μL) 加入到试管中，并加入一定浓度的沙美利定标样储备溶液，并加入4.8 mL庚烷，把使馆旋转摇振作用20min，进行离心处理(3000 rpm, 10 min)，把有机相转移到新的试管中，往溶液中加入440μL MIP 在乙醇（10 mg/mL ）MIP中的悬浮液，放置老化 1 h，把试管离心(3000 rpm, 15 min)，弃去悬浮物，往MIP中加入1.0 mL庚烷-乙醇（1：1 v/v)）进行涡旋，离心并弃掉悬浮物，再用1.70 mL庚烷，130μL乙醇和170μL 5M NaOH混合液处理MIP颗粒，连续涡旋 1 h，把试管离心(3000 rpm, 15 min)，把有机相转移到新的试管中，加入400μL 2.5M NaOH, 把试管涡旋然后离心，把有机相转移到硼硅玻璃试管中，并用氮气蒸发溶剂，残留物再溶解到150μL正庚烷-乙醇混合物(9:1; v/v)，进行GC分析。

文献

[1] L.I.Andersson，A.Paprica， T.Arvidsson， hromatographia,1997,46(3-4):57～62

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（68）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物SPE实际应用

奶制品中三聚氰胺的测定

这里为大家介绍王小如教授研究组最近发表的用印迹聚合物用于固相萃取分析奶制品中三聚氰胺的研究。

研究采用本体聚合法，以三聚氰胺为模板分子合成了对三聚氰胺具有特异性识别能力的分子印迹聚合物，并尝试把该印迹聚合物用于固相萃取奶制品提取液中的三聚氰胺。实验结果表明，以该印迹聚合物制备的固相萃取小柱能够有效地去除奶制品中的复杂基质 , 结合高效液相色谱能够方便快捷地用于奶制品中三聚氰胺的分离、分析。

（1）分子印迹聚合物的制备

分子印迹聚合物 (MIP)的合成采用本体聚合法，以三聚氰胺为模板分子, 甲基丙烯酸（MAA）为功能单体 ,乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂 , 偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂进行自由基引发聚合。

将三聚氰胺 0.5 mmol (63 mg) , MAA 6 mmol (505μL) , EG DMA 30 mmol (5660μL)分散于 7.5 mL乙醇 -水 (体积比 4 ∶ 1)的混合液中。超声分散 , 50℃下搅拌过夜。加入 0.25 mmol ( 41 mg)引发剂A I BN, 氮吹除氧 10 min后密封反应器,在氮气保护下在油浴中 60 ℃反应 24 h。得到的块状聚合物经研钵研磨 , 过 0.035～0.075 mm筛 , 得到粒径 0.035～0.075 mm的聚合物颗粒。用 10% (体积分数 )乙酸的甲醇溶液于索氏提取器中提取 48 h, 除去模板分子及未反应的化合物。然后用乙腈洗去残留的乙酸和甲醇,聚合物颗粒经丙酮反复沉降 , 除去细颗粒后,真空干燥至恒重,即为三聚氰胺的分子印迹聚合物。

(2) 奶制品中三聚氰胺的固相萃取

固相萃取柱的灌装与活化: 1 mL玻璃注射器底端用脱脂棉作为筛板,防止印迹聚合物颗粒的流失。取 100 mg印迹聚合物, 以乙腈为匀浆液,进行湿法装柱,氮气吹干柱子制得三聚氰胺印迹聚合物

固相萃取小柱。该柱依次用 2 mL水、2 mL甲醇活化 , 最终用氮气吹干备用。

固态奶 (奶粉 )的固相萃取: 向 5 g奶粉中加入甲醇 15 mL, 旋涡振荡 1 min, 超声提取 30 min。以10 000 r /min离心 5 min, 上清液作为固态奶提取液。向提取液中添加 0.02 mmol /L的三聚氰胺得到固态奶加标液。

将 1 mL固态奶加标液滴加至固相萃取小柱,以 0.25 mL /min过柱,并用氮气吹干。之后依次用 2mL水和 2 mL甲醇淋洗固相萃取小柱,流速为 0.25 mL /min, 并用氮气吹干。最后用 3 mL含 10% (体积分数 )浓氨水的甲醇洗脱,流速为 0.25 mL /min, 收集洗脱液。洗脱液氮吹浓缩至干 , 用甲醇定容至1 mL。加标液和洗脱液用高效液相色谱仪测定三聚氰胺的含量。

液态奶的固相萃取: 向 1 mL液态纯牛奶中加入 3 mL乙腈 , 除去蛋白。以 10 000 r /min离心5 min, 上清液作为液态奶提取液。提取液中添加 0.02 mmol /L的三聚氰胺得到加标液。

液态奶加标液过固相萃取小柱与固态奶加标液操作方法相同。

用HPLC测定样品中的三聚氰胺，色谱如图 98。



参考文献：

周文辉，,林黎明，郭秀春，杨黄浩，王小如，分析测试学报，2009，28（6）：687～691

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（69）

2．41 SPE 中的吸着剂（续）

分子印迹聚合物SPE实际应用

这里介绍一些我国分析化学家利用分子印迹SPE的工作

有关分子印迹SPE的摘要