吸光光度法
实训一 分光光度计的使用
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三、紫外可见分光光度计的构造
分光光度计按波长范围分类,波长在420~700nm范围的称可见分光光度计。波长在200~1000nm范围的称紫外可见分光光度计。
紫外可见分光光度计是目前厂矿及学校应用比较广泛的分光光度计。分光光度计基本构造相似,是由图6-2所示的几个主要部件构成
光源 单色器 吸收池 检测器 测量系统
1.光源:
在可见光区,常用钨丝灯为光源,波长范围约为320~2500nm;在紫外光区,常用氢灯、氘灯为光源,波长范围约为200~375nm。氘灯的辐射强度比氢灯高2~3倍,寿命亦较长。氙灯的强度一般高于氢灯,但欠稳定,适用的波长范围为180~1000nm,常用作荧光分光光度计的激发光源。
2.单色器:
单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的光学装置。白光通过棱镜或光栅将波长按长短顺序分散成单色光。单色器一般由五部分组成:入光狭缝;准光器(一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束);色散器;投影器(一般是一个透镜或凹面反射镜将分光后的单色光投影至出光狭缝);出光狭缝。
色散器是单色器的核心部分,常用的色散元件是棱镜或光栅。
棱镜由玻璃或石英制成,玻璃棱镜色散能力大,但吸收紫外光,只能用于350~820nm的分析测定,在紫外区必须用石英棱镜。
光栅是在玻璃表面上每毫米内刻有一定数量等宽等间距的平行条痕的一种色散元件。高质量的分光光度计采用全息光栅代替机械刻制和复制光栅。光栅的主要特点是色散均匀,呈线性,光度测量便于自动化,工作波段广。
光栅分光光度计的单色器光学系统原理见图6-3。
图6-3 单色器光学系统原理图
1一样品池;2一聚光镜;3一平面反射镜;4一入光狭缝;
5一出光狭缝;6一球面反射镜;7一平面光栅
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束经平面反射镜反射后射向球面反射镜,球面镜将平行光束反射至平面光栅,经光栅色散后的平行光束又经球面镜反射聚焦在出光狭缝处。
单色器的狭缝设计一定的宽度,经过狭缝的单色光是一个具有一定光谱宽度的谱带,称为光谱带宽。从理论上讲,狭缝的宽度愈小,波长愈接近单色光,但带宽太小,将使单色光的强度减小,使光电流信号减弱,降低信噪比。
由于分子吸收光谱的吸收峰比较宽和平滑,一般情况下光谱带宽2~6nm对分析结果影响不大。
3.吸收池:
吸收池是盛放样品溶液的容器,它具有两个相互平行、透光且具有精确厚度的平面。玻璃吸收池用于可见光区,石英吸收池用于紫外光区。吸收池的光程长度一般为1cm,也有0.1~
10cm的。由于吸收池厚度存在一定误差,其材质对光不是完全透明的,在作定量分析时,对吸收池应做配套性试验,试验后标记出放置。
4.检测器:
检测器是一种光电转换设备。它将光强度转变为电信号显示出来。常用的有光电池、光电管或光电倍增管等。光电池由于其光电流较大,不用放大,用于初级的分光光度计上。缺点是疲劳效应较严重。
光电管是常用的光电检测器,锑-铯阴极的紫敏光电管适用波长为200~625nm,银-氧化铯-铯阴极的红敏光电管适用波长为625~1000nm。
光电倍增管是目前应用最为广泛的检测器,它利用二次电子发射来放大光电流,放大倍数可高达108倍,性能好,唯独价格较高。
5.测量系统:
测量系统包括放大器和结果显示装置。早期的分光光度计用表头读数,70年代以来,采用数字读出装置。现代的分光光度计在主机中装备有微处理机或外接微型计算机,控制仪器操作和处理测量数据;装有屏幕显示、打印机和绘图仪等,使测量精密度、自动化程度提高,应用功能增加。
四、实训器材
1.高锰酸钾。
2.苯甲酸钠。
3. HCl(1+1)。
4.石油醚。
5.721可见分光光度计。
6.755紫外可见分光光度计。
7.分析天平
五、紫外可见分光光度计的使用方法
(一)721型分光光度计使用方法
l一波长读数盘;2一微安表;3一比色皿暗盒盖;4一波长调节器;5一“0”透射比调节器;
6一“100%”透射比调节器;7一比色皿架拉杆;8一灵敏度选择;9一电源开关
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表6-1 755B型分光光度计各功能键的功能
功能键 | 功能 |
I / O | 暂空 |
MEM | 方程存储键,直接按此键,当前内存中的方程被存储,并返回-记录号, 以备今后调用;若按过数字键后再按此键,则将内存中相对应的方程调入,按“0”+“MEM”,则将内存中所有方程清零。注:仪器第一次使用时,请将内存清零。 |
MODE | a. 初始响应,开机后必须按此键才能进入工作状态。 b.模式转换,连续按“MODE”键,仪器显示状态按T(透射比)-A(吸光度)-C(浓度)顺序轮回。 |
100%τ | 置满度,仪器在规定波长范围内的任意波长处,当参比试样置于光路时,按此键可在不同的显示模式状态下自动调整,在“T”状态显示“T100.0”,“A”状态显示“A0.000”,“C”状态(浓度)显示“C0.000”,另外当仪器显示“TE2”时,按此键仪器可自动调整至“T100.0”。 |
0% | 暗电流置零,打开样品池盖,若仪器显示值(暗电流)不为零,按此键即可调零。 |
C | 标准样品浓度值输入,仪器工作在C方式时,为建立浓度曲线而输入1~7点标准样品时用,操作方法详见本项目五.10.(2)建立A-C浓度曲线一节。 |
M/N | a.方程系数M、N轮回显示键,没有方程则显示“NO”。 b.浓度曲线系数输入键,使用方法详见本项目五.10.(1)建立浓度曲线一节。 |
CLEAR | 浓度曲线系数输入健,按此键则清除机内原有的曲线方程,在C模式下显示“CEO”。 注:在每次建立浓度方程前必须先按此键清除原有的浓度方程。 |
CE | 清除键,如数字输入过程中发生错误,按此键可清除。 |
TABLE | 打印当前浓度方程及内存中的所有浓度方程系数和记录号。 |
打印键,用法详见本项目五.11打印方式一节。 |
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六、实训步骤
1.721型分光光度计测定高锰酸钾溶液的吸光度:
(1)称取1.6g高锰酸钾固体,置于烧杯中溶解,定容至1000mL,混匀,该溶液浓度约为0.01mol/L。
分别取0.01 mol/L高锰酸钾溶液,1.00mL、2.00mL 、3.00mL置于100mL容量瓶中,定容后分别配制成 0.0001mol/L、0.0002mol/L、0.0003mol/L的高锰酸钾溶液,备用。
(2)将配置好的各种浓度的高锰酸钾标准溶液分别在500nm、525nm、550nm和575nm波长条件下,测定吸光度,记录数据。
2.755B型分光光度计测定苯甲酸钠溶液的吸光度:
(1)配置2.00mg/mL苯甲酸钠标准溶液。分别吸取1.00mL、3.00mL、5.00mL苯甲酸钠标准溶液于100mL容量瓶中,分别用蒸馏水定容至刻度线,摇匀备用。
(2)分别吸取稀苯甲酸钠标准溶液5mL,另吸取5mL蒸馏水作空白溶液,加0.4mL HCl(1+1),用石油醚稀释至50mL。振动1min。以空白溶液为参比,分别在234nm、254nm、280nm波长条件下,测定石油醚层的吸光度,记录数据。
七、注意事项
1.发现仪器有故障时,应先仔细分析,确定故障的关键,然后着手解决,切忌盲目行事。
2.避免有硫化氢、二氧化氢、氟气等有腐蚀气体的场所,避免灰尘过多的地方
3.环境温度在15~35℃,环境相对湿度在45~85%范围内
4.避免经常有强烈震动的地方,避免阳光直射的地方
5.仪器应尽量远离发强烈电场、磁场或高频的电气设备
6.放置本仪器的工作台,必须有足够强度能承受30kg的重量,仪器后测应距离墙壁至少 10cm以上,以保证及时散热。
7.755B型分光光度计打印的几点说明:
(l)定时打印T范围5~99(秒)
(2)定时打印次数1~255(次)
思考题
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实训二 高锰酸钾溶液吸收曲线的制作
思 考 题
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实训三 邻二氮杂菲分光光度法测定铁
4Fe3+ + 2NH2OH 4Fe2+ + 4H+ + N2O + H2O
思 考 题