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用PITC衍生化测定甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量

ywxk

2012/01/31

液相色谱（LC）

用PITC衍生化测定甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量

测定步骤：

1. 用纯水配制甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合液，其浓度都大约为0.05mg/mL，得到甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合标准溶液。

2. 配制1.2%PITC乙腈溶液和14%TEA乙腈溶液。

3. 衍生化过程：取200uL氨基酸混合标准溶液于1.5mL离心管中，然后加入100uL1.2%PITC乙腈溶液和100uL14%TEA乙腈溶液，摇震使其混合均匀，然后于水浴锅中水浴加热1小时，然后加入500uL正己烷萃取两次，最后取下层液200uL于HPLC瓶中,然后再加入400uL水稀释，用HPLC分析。

色谱条件：

柱子：Agilent SB-Aq 250mm*4.6mm, 5um

流动相A：50mM NaAC (pH=6.5)

流动相B：50mM NaAC (pH=6.5):ACN=1:1

Time:0-10-25-40min

B%:5%-5%-95%-95%

进样量10uL

出现问题：

1. 甘氨酸和谷氨酰胺衍生化峰会分叉。

2. 会出现很多杂峰，尤其是在强洗脱部分。

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tangtang

第1楼2012/01/31

有没有换柱子做过？

0

有水有渝

第2楼2012/02/01

应助达人

楼主能上个图吗，柱子问题的可能性比较大，同时做一个空白看看试剂有没有问题，流动相的PH也确认一下。

0

ywxk

第3楼2012/02/09

附上图，每个氨基酸衍生物都会有个副产物峰

0

老多_小多

第4楼2012/02/09

你那个图，是标准还是样品呀，如果是标准，那就是有问题了

0

sunely

第5楼2018/01/18

我也遇到了同样的问题，请问有解决方法吗？

0

hujiangtao

第6楼2018/02/26

应助达人

柱前衍生不如柱后的稳定

0

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